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背景
冠状病毒（Coronavirus,CoV）是有包膜的单股正链RNA病毒，目前发现能感染人的六种冠状病毒中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus,SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus,MERS-CoV）属于高致病性冠状病毒，能引起严重的呼吸道感染，甚至导致呼吸衰竭。迄今为止仍没有商品化的SARS-CoV和MERS-CoV预防疫苗和特效治疗药物。
SARS-CoV和MERS-CoV基因组全长约30kb，包含刺突蛋白（spike,S）、囊膜蛋白（envelope,E）、膜蛋白（membrane,M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid,N）4种结构蛋白基因和其它非结构蛋白基因。位于病毒粒子表面的S蛋白是SARS-CoV和MERS-CoV重要的结构蛋白，在病毒感染过程中介导与宿主细胞受体的结合和膜融合过程。S蛋白由S1和S2两个亚单位组成，其中S1主要包含N端结构域（N-terminaldomain，NTD）和受体结合区（receptorbindingdomain，RBD）两个区域。S蛋白是诱导免疫反应的重要靶抗原，也是病原检测、疫苗研发和疾病防控的重点，选用合适的真核表达系统高效制备S蛋白及相关抗原是进行相关研究的前提。
SARS-CoV和MERS-CoV同属于β属冠状病毒，二者具有相似的基因组结构，保守蛋白基因具有很高的相似性，已有研究发现了SARS-CoV和类SARS-CoV交叉反应性抗体的存在，但是SARS-CoV和MERS-CoV之间是否有交叉反应目前仍没有明确的研究报道。SARS-CoVS单克隆抗体在SARS-CoV的治疗、检测及致病机理的研究中具有重要应用，但SARS-CoVS单克隆抗体的研究相对较少，有必要对其进行深入研究并探索SARS-CoV单抗的应用价值，特别是SARS-CoV和MERS-CoV交叉抗体的研究对高致病性冠状病毒的防控具有重要意义。
研究目的
建立高效表达MERS-CoVS1蛋白的真核表达系统，为MERS-CoV血清学检测和亚单位疫苗研发提供技术支持，并为其他糖蛋白的真核表达提供参考；制备SARS-CoVS蛋白鼠源性单克隆抗体并对其特性进行研究。
研究方法及结果
1.MERS-CoV/SARS-CoV刺突蛋白相关抗原的真核表达
研究方法：PCR扩增GLuc、tPA、MIgG2a信号肽基因序列，替换真核表达载体pLQ-uni的原始信号肽GLuc-3，共构建7个含GLuc、tPA、MIgG2a原始及突变信号肽序列的真核表达载体，将MERS-CoVS1基因分别克隆至7个表达载体，构建7个含不同信号肽序列的pLQ-uni-S1表达质粒，各质粒同等条件分别转染BHK21、293T、ExpiCHO-STM细胞，收获细胞培养上清和细胞裂解液，进行Westernblot检测，扫描各条带灰度值分析上清和裂解液中MERS-CoVS1的相对表达量。
结果：在293T、BHK21和ExpiCHO-STM三种细胞中7种信号肽介导MERS-CoVS1的分泌表达的效率各有不同，其中tPA-1信号肽介导MERS-CoVS1抗原在ExpiCHO-STM中具有较高的分泌表达效率与产量。经ExpiCHO-STM系统大量表达与纯化，获得了纯度大于90%且保持较好的抗原性的MERS-CoVS1蛋白。对ExpiCHO-STM表达纯化的S1进行抗原性分析，MERS-CoVS1具有较好的抗原性。利用ExpiCHO-STM表达纯化的MERS-CoVS1检测18例WHO样本，S1与商品化欧蒙试剂盒（S1）的检测结果相当。利用pLQ-tPA-1表达载体在293T系统表达、纯化SARS-CoVS1、S2、NTD，成功获得纯度大于90%且抗原性良好的SARS-CoVS1和NTD，而SARS-CoVS2因与杂蛋白洗脱峰重叠未获得目的蛋白。
2.SARS-CoV刺突蛋白鼠源性单抗的制备与鉴定
研究方法：将不同表达系统来源的SARS-CoVS蛋白序贯免疫小鼠，诱导小鼠产生高滴度的抗体，通过PEG细胞融合技术筛选到5株SARS-CoVS蛋白抗体分泌阳性单克隆杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔大量表达单克隆抗体，硫酸铵沉淀和ProteinG亲和层析对单抗进行纯化。通过SDS-PAGE电泳对单抗纯度进行鉴定，利用ELISA对抗体亚型和抗体表位进行分析，采用BLI检测了其中3株单抗与SARS-CoVS蛋白的亲和力，用HRP标记其中2株单抗，通过双抗体夹心ELISA验证了其在免疫学检测中的应用，并进行SARS-CoVS假病毒中和实验验证单抗的中和活性。
结果：纯化的单抗纯度都能达到要求；单抗4B10C9和4B4B10针对的表位为RBD区域，单抗1C8F9为NTD区域抗体，7C11G2可能是针对S2区域的单抗，而7G10C5可能是针对标签蛋白的单抗；4B4B105和1C8F9与SARS-CoVS蛋白具有皮摩尔级别的亲和力；4B4B105和1C8F9配对能有效检测到SARS-CoVS/S1和灭活SARS-CoV疫苗；5株单抗中仅4B4B10具有假病毒中和活性，IC50约0.8μg/ml。
结论
tPA-1信号肽介导MERS-CoVS1抗原在ExpiCHO-STM中的高效分泌表达，纯化的MERS-CoVS1蛋白具有良好的抗原性，同样的表达系统成功应用于SARS-CoVS蛋白相关抗原的真核表达，这为外源蛋白在真核细胞中的分泌表达提供了技术参考，也为分泌性蛋白质的结构、功能研究以及疫苗、检测试剂研发奠定了实验基础；本研究筛选到5株SARS-CoVS蛋白单抗，为SARS-CoV检测及探讨SARS-CoV和MERS-CoV的抗体交叉反应奠定了技术基础。
冠状病毒（Coronavirus,CoV）是有包膜的单股正链RNA病毒，目前发现能感染人的六种冠状病毒中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus,SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus,MERS-CoV）属于高致病性冠状病毒，能引起严重的呼吸道感染，甚至导致呼吸衰竭。迄今为止仍没有商品化的SARS-CoV和MERS-CoV预防疫苗和特效治疗药物。
SARS-CoV和MERS-CoV基因组全长约30kb，包含刺突蛋白（spike,S）、囊膜蛋白（envelope,E）、膜蛋白（membrane,M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid,N）4种结构蛋白基因和其它非结构蛋白基因。位于病毒粒子表面的S蛋白是SARS-CoV和MERS-CoV重要的结构蛋白，在病毒感染过程中介导与宿主细胞受体的结合和膜融合过程。S蛋白由S1和S2两个亚单位组成，其中S1主要包含N端结构域（N-terminaldomain，NTD）和受体结合区（receptorbindingdomain，RBD）两个区域。S蛋白是诱导免疫反应的重要靶抗原，也是病原检测、疫苗研发和疾病防控的重点，选用合适的真核表达系统高效制备S蛋白及相关抗原是进行相关研究的前提。
SARS-CoV和MERS-CoV同属于β属冠状病毒，二者具有相似的基因组结构，保守蛋白基因具有很高的相似性，已有研究发现了SARS-CoV和类SARS-CoV交叉反应性抗体的存在，但是SARS-CoV和MERS-CoV之间是否有交叉反应目前仍没有明确的研究报道。SARS-CoVS单克隆抗体在SARS-CoV的治疗、检测及致病机理的研究中具有重要应用，但SARS-CoVS单克隆抗体的研究相对较少，有必要对其进行深入研究并探索SARS-CoV单抗的应用价值，特别是SARS-CoV和MERS-CoV交叉抗体的研究对高致病性冠状病毒的防控具有重要意义。
研究目的
建立高效表达MERS-CoVS1蛋白的真核表达系统，为MERS-CoV血清学检测和亚单位疫苗研发提供技术支持，并为其他糖蛋白的真核表达提供参考；制备SARS-CoVS蛋白鼠源性单克隆抗体并对其特性进行研究。
研究方法及结果
1.MERS-CoV/SARS-CoV刺突蛋白相关抗原的真核表达
研究方法：PCR扩增GLuc、tPA、MIgG2a信号肽基因序列，替换真核表达载体pLQ-uni的原始信号肽GLuc-3，共构建7个含GLuc、tPA、MIgG2a原始及突变信号肽序列的真核表达载体，将MERS-CoVS1基因分别克隆至7个表达载体，构建7个含不同信号肽序列的pLQ-uni-S1表达质粒，各质粒同等条件分别转染BHK21、293T、ExpiCHO-STM细胞，收获细胞培养上清和细胞裂解液，进行Westernblot检测，扫描各条带灰度值分析上清和裂解液中MERS-CoVS1的相对表达量。
结果：在293T、BHK21和ExpiCHO-STM三种细胞中7种信号肽介导MERS-CoVS1的分泌表达的效率各有不同，其中tPA-1信号肽介导MERS-CoVS1抗原在ExpiCHO-STM中具有较高的分泌表达效率与产量。经ExpiCHO-STM系统大量表达与纯化，获得了纯度大于90%且保持较好的抗原性的MERS-CoVS1蛋白。对ExpiCHO-STM表达纯化的S1进行抗原性分析，MERS-CoVS1具有较好的抗原性。利用ExpiCHO-STM表达纯化的MERS-CoVS1检测18例WHO样本，S1与商品化欧蒙试剂盒（S1）的检测结果相当。利用pLQ-tPA-1表达载体在293T系统表达、纯化SARS-CoVS1、S2、NTD，成功获得纯度大于90%且抗原性良好的SARS-CoVS1和NTD，而SARS-CoVS2因与杂蛋白洗脱峰重叠未获得目的蛋白。
2.SARS-CoV刺突蛋白鼠源性单抗的制备与鉴定
研究方法：将不同表达系统来源的SARS-CoVS蛋白序贯免疫小鼠，诱导小鼠产生高滴度的抗体，通过PEG细胞融合技术筛选到5株SARS-CoVS蛋白抗体分泌阳性单克隆杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔大量表达单克隆抗体，硫酸铵沉淀和ProteinG亲和层析对单抗进行纯化。通过SDS-PAGE电泳对单抗纯度进行鉴定，利用ELISA对抗体亚型和抗体表位进行分析，采用BLI检测了其中3株单抗与SARS-CoVS蛋白的亲和力，用HRP标记其中2株单抗，通过双抗体夹心ELISA验证了其在免疫学检测中的应用，并进行SARS-CoVS假病毒中和实验验证单抗的中和活性。
结果：纯化的单抗纯度都能达到要求；单抗4B10C9和4B4B10针对的表位为RBD区域，单抗1C8F9为NTD区域抗体，7C11G2可能是针对S2区域的单抗，而7G10C5可能是针对标签蛋白的单抗；4B4B105和1C8F9与SARS-CoVS蛋白具有皮摩尔级别的亲和力；4B4B105和1C8F9配对能有效检测到SARS-CoVS/S1和灭活SARS-CoV疫苗；5株单抗中仅4B4B10具有假病毒中和活性，IC50约0.8μg/ml。
结论
tPA-1信号肽介导MERS-CoVS1抗原在ExpiCHO-STM中的高效分泌表达，纯化的MERS-CoVS1蛋白具有良好的抗原性，同样的表达系统成功应用于SARS-CoVS蛋白相关抗原的真核表达，这为外源蛋白在真核细胞中的分泌表达提供了技术参考，也为分泌性蛋白质的结构、功能研究以及疫苗、检测试剂研发奠定了实验基础；本研究筛选到5株SARS-CoVS蛋白单抗，为SARS-CoV检测及探讨SARS-CoV和MERS-CoV的抗体交叉反应奠定了技术基础。