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背景
冠状病毒(Coronavirus,CoV)是有包膜的单股正链RNA病毒,目前发现能感染人的六种冠状病毒中严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus,SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus,MERS-CoV)属于高致病性冠状病毒,能引起严重的呼吸道感染,甚至导致呼吸衰竭。迄今为止仍没有商品化的SARS-CoV和MERS-CoV预防疫苗和特效治疗药物。
SARS-CoV和MERS-CoV基因组全长约30kb,包含刺突蛋白(spike,S)、囊膜蛋白(envelope,E)、膜蛋白(membrane,M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)4种结构蛋白基因和其它非结构蛋白基因。位于病毒粒子表面的S蛋白是SARS-CoV和MERS-CoV重要的结构蛋白,在病毒感染过程中介导与宿主细胞受体的结合和膜融合过程。S蛋白由S1和S2两个亚单位组成,其中S1主要包含N端结构域(N-terminaldomain,NTD)和受体结合区(receptorbindingdomain,RBD)两个区域。S蛋白是诱导免疫反应的重要靶抗原,也是病原检测、疫苗研发和疾病防控的重点,选用合适的真核表达系统高效制备S蛋白及相关抗原是进行相关研究的前提。
SARS-CoV和MERS-CoV同属于β属冠状病毒,二者具有相似的基因组结构,保守蛋白基因具有很高的相似性,已有研究发现了SARS-CoV和类SARS-CoV交叉反应性抗体的存在,但是SARS-CoV和MERS-CoV之间是否有交叉反应目前仍没有明确的研究报道。SARS-CoVS单克隆抗体在SARS-CoV的治疗、检测及致病机理的研究中具有重要应用,但SARS-CoVS单克隆抗体的研究相对较少,有必要对其进行深入研究并探索SARS-CoV单抗的应用价值,特别是SARS-CoV和MERS-CoV交叉抗体的研究对高致病性冠状病毒的防控具有重要意义。
研究目的
建立高效表达MERS-CoVS1蛋白的真核表达系统,为MERS-CoV血清学检测和亚单位疫苗研发提供技术支持,并为其他糖蛋白的真核表达提供参考;制备SARS-CoVS蛋白鼠源性单克隆抗体并对其特性进行研究。
研究方法及结果
1.MERS-CoV/SARS-CoV刺突蛋白相关抗原的真核表达
研究方法:PCR扩增GLuc、tPA、MIgG2a信号肽基因序列,替换真核表达载体pLQ-uni的原始信号肽GLuc-3,共构建7个含GLuc、tPA、MIgG2a原始及突变信号肽序列的真核表达载体,将MERS-CoVS1基因分别克隆至7个表达载体,构建7个含不同信号肽序列的pLQ-uni-S1表达质粒,各质粒同等条件分别转染BHK21、293T、ExpiCHO-STM细胞,收获细胞培养上清和细胞裂解液,进行Westernblot检测,扫描各条带灰度值分析上清和裂解液中MERS-CoVS1的相对表达量。
结果:在293T、BHK21和ExpiCHO-STM三种细胞中7种信号肽介导MERS-CoVS1的分泌表达的效率各有不同,其中tPA-1信号肽介导MERS-CoVS1抗原在ExpiCHO-STM中具有较高的分泌表达效率与产量。经ExpiCHO-STM系统大量表达与纯化,获得了纯度大于90%且保持较好的抗原性的MERS-CoVS1蛋白。对ExpiCHO-STM表达纯化的S1进行抗原性分析,MERS-CoVS1具有较好的抗原性。利用ExpiCHO-STM表达纯化的MERS-CoVS1检测18例WHO样本,S1与商品化欧蒙试剂盒(S1)的检测结果相当。利用pLQ-tPA-1表达载体在293T系统表达、纯化SARS-CoVS1、S2、NTD,成功获得纯度大于90%且抗原性良好的SARS-CoVS1和NTD,而SARS-CoVS2因与杂蛋白洗脱峰重叠未获得目的蛋白。
2.SARS-CoV刺突蛋白鼠源性单抗的制备与鉴定
研究方法:将不同表达系统来源的SARS-CoVS蛋白序贯免疫小鼠,诱导小鼠产生高滴度的抗体,通过PEG细胞融合技术筛选到5株SARS-CoVS蛋白抗体分泌阳性单克隆杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔大量表达单克隆抗体,硫酸铵沉淀和ProteinG亲和层析对单抗进行纯化。通过SDS-PAGE电泳对单抗纯度进行鉴定,利用ELISA对抗体亚型和抗体表位进行分析,采用BLI检测了其中3株单抗与SARS-CoVS蛋白的亲和力,用HRP标记其中2株单抗,通过双抗体夹心ELISA验证了其在免疫学检测中的应用,并进行SARS-CoVS假病毒中和实验验证单抗的中和活性。
结果:纯化的单抗纯度都能达到要求;单抗4B10C9和4B4B10针对的表位为RBD区域,单抗1C8F9为NTD区域抗体,7C11G2可能是针对S2区域的单抗,而7G10C5可能是针对标签蛋白的单抗;4B4B105和1C8F9与SARS-CoVS蛋白具有皮摩尔级别的亲和力;4B4B105和1C8F9配对能有效检测到SARS-CoVS/S1和灭活SARS-CoV疫苗;5株单抗中仅4B4B10具有假病毒中和活性,IC50约0.8μg/ml。
结论
tPA-1信号肽介导MERS-CoVS1抗原在ExpiCHO-STM中的高效分泌表达,纯化的MERS-CoVS1蛋白具有良好的抗原性,同样的表达系统成功应用于SARS-CoVS蛋白相关抗原的真核表达,这为外源蛋白在真核细胞中的分泌表达提供了技术参考,也为分泌性蛋白质的结构、功能研究以及疫苗、检测试剂研发奠定了实验基础;本研究筛选到5株SARS-CoVS蛋白单抗,为SARS-CoV检测及探讨SARS-CoV和MERS-CoV的抗体交叉反应奠定了技术基础。
冠状病毒(Coronavirus,CoV)是有包膜的单股正链RNA病毒,目前发现能感染人的六种冠状病毒中严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus,SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus,MERS-CoV)属于高致病性冠状病毒,能引起严重的呼吸道感染,甚至导致呼吸衰竭。迄今为止仍没有商品化的SARS-CoV和MERS-CoV预防疫苗和特效治疗药物。
SARS-CoV和MERS-CoV基因组全长约30kb,包含刺突蛋白(spike,S)、囊膜蛋白(envelope,E)、膜蛋白(membrane,M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)4种结构蛋白基因和其它非结构蛋白基因。位于病毒粒子表面的S蛋白是SARS-CoV和MERS-CoV重要的结构蛋白,在病毒感染过程中介导与宿主细胞受体的结合和膜融合过程。S蛋白由S1和S2两个亚单位组成,其中S1主要包含N端结构域(N-terminaldomain,NTD)和受体结合区(receptorbindingdomain,RBD)两个区域。S蛋白是诱导免疫反应的重要靶抗原,也是病原检测、疫苗研发和疾病防控的重点,选用合适的真核表达系统高效制备S蛋白及相关抗原是进行相关研究的前提。
SARS-CoV和MERS-CoV同属于β属冠状病毒,二者具有相似的基因组结构,保守蛋白基因具有很高的相似性,已有研究发现了SARS-CoV和类SARS-CoV交叉反应性抗体的存在,但是SARS-CoV和MERS-CoV之间是否有交叉反应目前仍没有明确的研究报道。SARS-CoVS单克隆抗体在SARS-CoV的治疗、检测及致病机理的研究中具有重要应用,但SARS-CoVS单克隆抗体的研究相对较少,有必要对其进行深入研究并探索SARS-CoV单抗的应用价值,特别是SARS-CoV和MERS-CoV交叉抗体的研究对高致病性冠状病毒的防控具有重要意义。
研究目的
建立高效表达MERS-CoVS1蛋白的真核表达系统,为MERS-CoV血清学检测和亚单位疫苗研发提供技术支持,并为其他糖蛋白的真核表达提供参考;制备SARS-CoVS蛋白鼠源性单克隆抗体并对其特性进行研究。
研究方法及结果
1.MERS-CoV/SARS-CoV刺突蛋白相关抗原的真核表达
研究方法:PCR扩增GLuc、tPA、MIgG2a信号肽基因序列,替换真核表达载体pLQ-uni的原始信号肽GLuc-3,共构建7个含GLuc、tPA、MIgG2a原始及突变信号肽序列的真核表达载体,将MERS-CoVS1基因分别克隆至7个表达载体,构建7个含不同信号肽序列的pLQ-uni-S1表达质粒,各质粒同等条件分别转染BHK21、293T、ExpiCHO-STM细胞,收获细胞培养上清和细胞裂解液,进行Westernblot检测,扫描各条带灰度值分析上清和裂解液中MERS-CoVS1的相对表达量。
结果:在293T、BHK21和ExpiCHO-STM三种细胞中7种信号肽介导MERS-CoVS1的分泌表达的效率各有不同,其中tPA-1信号肽介导MERS-CoVS1抗原在ExpiCHO-STM中具有较高的分泌表达效率与产量。经ExpiCHO-STM系统大量表达与纯化,获得了纯度大于90%且保持较好的抗原性的MERS-CoVS1蛋白。对ExpiCHO-STM表达纯化的S1进行抗原性分析,MERS-CoVS1具有较好的抗原性。利用ExpiCHO-STM表达纯化的MERS-CoVS1检测18例WHO样本,S1与商品化欧蒙试剂盒(S1)的检测结果相当。利用pLQ-tPA-1表达载体在293T系统表达、纯化SARS-CoVS1、S2、NTD,成功获得纯度大于90%且抗原性良好的SARS-CoVS1和NTD,而SARS-CoVS2因与杂蛋白洗脱峰重叠未获得目的蛋白。
2.SARS-CoV刺突蛋白鼠源性单抗的制备与鉴定
研究方法:将不同表达系统来源的SARS-CoVS蛋白序贯免疫小鼠,诱导小鼠产生高滴度的抗体,通过PEG细胞融合技术筛选到5株SARS-CoVS蛋白抗体分泌阳性单克隆杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔大量表达单克隆抗体,硫酸铵沉淀和ProteinG亲和层析对单抗进行纯化。通过SDS-PAGE电泳对单抗纯度进行鉴定,利用ELISA对抗体亚型和抗体表位进行分析,采用BLI检测了其中3株单抗与SARS-CoVS蛋白的亲和力,用HRP标记其中2株单抗,通过双抗体夹心ELISA验证了其在免疫学检测中的应用,并进行SARS-CoVS假病毒中和实验验证单抗的中和活性。
结果:纯化的单抗纯度都能达到要求;单抗4B10C9和4B4B10针对的表位为RBD区域,单抗1C8F9为NTD区域抗体,7C11G2可能是针对S2区域的单抗,而7G10C5可能是针对标签蛋白的单抗;4B4B105和1C8F9与SARS-CoVS蛋白具有皮摩尔级别的亲和力;4B4B105和1C8F9配对能有效检测到SARS-CoVS/S1和灭活SARS-CoV疫苗;5株单抗中仅4B4B10具有假病毒中和活性,IC50约0.8μg/ml。
结论
tPA-1信号肽介导MERS-CoVS1抗原在ExpiCHO-STM中的高效分泌表达,纯化的MERS-CoVS1蛋白具有良好的抗原性,同样的表达系统成功应用于SARS-CoVS蛋白相关抗原的真核表达,这为外源蛋白在真核细胞中的分泌表达提供了技术参考,也为分泌性蛋白质的结构、功能研究以及疫苗、检测试剂研发奠定了实验基础;本研究筛选到5株SARS-CoVS蛋白单抗,为SARS-CoV检测及探讨SARS-CoV和MERS-CoV的抗体交叉反应奠定了技术基础。