捕食性真菌的代表种—Duddingtonia flagrans具有强大的环境耐受力和捕食能力,使其成为最有希望代替化学药物的生物制剂菌种。目前,国内外学者已针对该菌做过大量的形态学观察、生物学特性研究以及临床杀虫效果实验,但目前还没有有关其捕食线虫过程分子机制的完整信息。而研究捕食性真菌作用线虫的分子背景和侵染机制,可以为我们合理利用捕食性真菌、开发高效和稳定的生防治剂提供理论基础。鉴于此,本研究以具有巨大生物防治应用前景的捕食性真菌—D.flagrans为研究对象,在筛选确定适于该菌菌丝体蛋白提取方法的基础上,采用iTRAQ技术对其不同捕食时期的菌丝体蛋白质组进行分析,明确了不同作用阶段的菌丝在蛋白质水平上的变化,进而发现了与捕食线虫相关的关键蛋白质,并对其进行了荧光定量PCR验证。从蛋白质水平上揭示该菌的捕食过程,丰富了我们对捕食性真菌的认识,揭示了其侵染和消化线虫过程及其生活方式转变的分子机制。主要研究成果具体如下:(1)分别采用尿素-硫脲裂解法、蜗牛酶消化法、试剂盒提取法和TCA-丙酮-SDT裂解液法提取了D.flagrans菌丝体蛋白,综合Bradford浓度检测和SDS-PAGE考马斯亮蓝染色的实验结果,发现液氮研磨结合试剂盒法是制备捕食性真菌D.flagrans胞内蛋白质的最佳方法,但对于蛋白质组学研究来说,以TCA-丙酮-SDT裂解液法较好。(2)通过电子扫描显微镜观察捕食性真菌D.flagrans捕食线虫的过程,将捕食过程划分为三个阶段,即捕食前期(0h)、捕食中期(12h)和捕食后期(48h、72h),并分别在这些时间点收集真菌样本,以经蒸馏水诱导的D.flagrans菌丝体为对照组(DF组),以加入秀丽隐杆线虫提取液诱导的D.flagrans菌丝体为试验组(CE组),利用iTRAQ技术进行定性和定量分析。结果显示:在自建库中共鉴定到蛋白质4244个,其中,在对照组中,72h与12h相比,差异蛋白最多,共有572个;48h与0h相比,差异蛋白最少,有144个。在实验组中,12h与0h相比,差异蛋白最多,共鉴定出474个;72h与48h相比,鉴定到的差异蛋白最少,只有27个。相同时间点试验组与对照组相比,48h时的差异蛋白最多,共有296个;72h差异蛋白最少,共有104个。对各处理组的差异蛋白进行GO功能分析,结果发现差异蛋白在真菌的有关催化活动、分子结合功能、转运活动、代谢过程、生物调节、应激反应、生物定位、碳利用以及物质的合成均呈现显著的动态变化;诸如酸性磷酸酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、纤维素酶、丝氨酸蛋白酶、中性神经酰胺酶、鞘磷脂磷酸二酯酶和酪氨酸酶等呈差异表达,表明这些蛋白可能在捕食过程有重要作用;进一步通过KEGG富集分析发现,差异蛋白参与的代谢通路主要涉及泛素介导的蛋白水解、内质网蛋白加工、鞘脂类代谢、粘附过程、MAPK信号通路、AMPK信号通路、能量代谢和碳代谢、过氧物酶体、氧化磷酸化等八大类,这些通路均与真菌捕食线虫作用过程相关。这些研究结果为揭示捕食器产生、真菌作用线虫过程中和真菌自身的生物进程变化,筛选鉴定捕食相关蛋白质奠定了基础,也为今后阐明捕食性真菌D.flagrans捕食线虫的机制提供了有力支撑。(3)根据iTRAQ分析结果,筛选了其中12种与捕食功能有关的目的蛋白,进行了荧光定量PCR验证发现半数以上基因表达结果与iTRAQ结果一致,间接说明了蛋白质组测序与分析的准确性,结果可靠。