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欧李是我国独有的灌木果树资源,植株耐寒、耐旱、耐瘠薄,水土保持能力强,果实色泽鲜艳、类型多样,富含有机酸、氨基酸、花色苷、单宁、黄烷酮、黄酮醇等多种营养和生物活性物质,潜在基因非常丰富。当前欧李杂交育种中,亲本的选配更多参考外观性状和生理指标,准确性不高。因此,利用现代生物技术发掘欧李优异种质基因,对开展定向育种具有重要意义。欧李果实酸度高,酸度是影响欧李果实品质的首要因素,也是当前欧李育种重要的品质指标。苹果酸是欧李果实中最主要的有机酸,品种间含量差异较大,在欧李果实酸度形成中起到重要作用。本研究选择三个果实色泽和苹果酸含量不同的欧李品种‘农大3号’、‘农大4号’、‘农大5号’,对其发育后期果实样本进行转录组测序,分析品种间的基因表达差异,挖掘优异基因。利用RT-PCR和转录组测序信息,克隆了参与欧李苹果酸积累的三个关键酶基因并进行了序列分析。分析了果实发育过程中的基因表达变化以及基因表达、酶活性与苹果酸累积的关系,为深入研究欧李苹果酸积累的分子机制奠定了基础。主要研究结果如下：1、通过Illumina Hiseq2000平台,分别对三个品种发育后期果实的转录组进行测序,总计产出数据19282809960nt。测序所得的Clean reads用Trinity软件组装,‘农大3号’、‘农大4号’、‘农大5号’分别获得37222、37856、38390个Unigene,三个品种所得到的Unigene进一步序列拼接和去冗余处理后得到非冗余All-Unigene 39347个,序列长度从300bp到8531bp,其中长度大于3000bp的有2505个。将Unigene序列与6个数据库(evalue<0.00001)进行比对,共有31,726个Unigene获得了基因注释。其中,注释到NR, NT, Swiss-Prot, KEGG, COG, GO数据库的Unigene分别为30332、29410、20093、18230、12562和22844个。2、根据NR数据库进行相似性分析,相似度在95%-100%的蛋白为18784个,占总数的61.93%,物种分布分析表明欧李有26991个Unigene与桃(Amygdalus persica)有较高同源性,占总数的88.99%。转录组测序结果中有18,230个Unigene在KEGG数据库中获得了注释,其中4084个Unigene在代谢途径中获得注释,占22.4%；1807个Unigene为次生代谢产物生物合成途径,占9.91%；1428个Unigene属于植物与病原物的互作,占7.83%。转录组中发现类型丰富的SSR,其中,单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复是优势类型,分别占总SSR的11.94%、54.60%和27.76%,以6次重复的SSR最多,占20.98%。3、品种间差异表达基因统计表明,‘农大4号’、‘农大5号’分别有3766个、3537个Unigene表达量高于‘农大3号’,‘农大5号’有3008个Unigene表达量高于‘农大4号’。在转录组数据库中找到了与MDH、ME、VHA三个基因对应的注释Unigene。基因表达差异分析表明,苹果酸脱氢酶基因MDH对应的Unigene在‘农大4号’中表达最高,苹果酸酶基因ME对应的Unigene在‘农大3号’中表达量最高,这是两个品种苹果酸积累差异的重要原因。4、品种间差异表达基因的GO功能显著性富集分析表明,‘农大3号’和‘农大4号’比较,在细胞组分中细胞周边是差异表达基因最显著富集的；在分子功能中四吡咯结合与花色苷3-O-葡萄糖基转移酶活性是差异表达基因中最显著富集的；在生物过程中含氧化合物的反应、离子转运和创伤响应是差异表达基因中显著富集的。‘农大4号’和‘农大5号’比较,在细胞组分中胞外区域是差异表达基因最显著富集的,在分子功能中氧化还原酶活性是差异表达基因中最显著富集的,在生物过程中远红光反应是差异表达基因中最显著富集的。‘农大3号’和‘农大5号’比较,细胞组分中胞外区域是差异表达基因中最显著富集的,在分子功能中四吡咯结合、亚铁血红素结合是差异表达基因中最显著富集的；在生物过程中壳质反应、木质素代谢、突发性呼吸是差异表达基因中最显著富集的。5、品种间差异表达基因的Pathway分析表明,三个品种相比,最显著富集的基因集中于次生代谢物的生物合成,而在次生代谢物生物合成中又最显著富集于类黄酮生物合成。在类黄酮生物合成途径中,‘农大3号’和‘农大4号’有77个差异表达基因,‘农大4号’和‘农大5号’有53个差异表达基因,‘农大3号’和‘农大5号’有55个差异表达基因。‘农大4号’中,CHS、F3H、F3’5’H、ANR、LAR、UFGT的表达量高于‘农大3号’；‘农大5号’中,CHS、ANR、UFGT的表达量低于‘农大4号’,而LAR的表达量高于‘农大4号’；‘农大5号’中CHS、F3’5’H、DRF、ANR、LAR的表达量高于‘农大3号’,而UFGT的表达量低于‘农大3号’。6、根据欧李转录组数据设计全长引物,获得了欧李苹果酸代谢相关基因ChMDH、 ChME、ChVHA的编码区序列,并分析了三个基因编码蛋白的理化性质,预测分析其蛋白二级结构及三维结构,序列分析表明这些基因与桃、苹果、梨的同类基因同源性很高。进一步的研究表明,参与苹果酸合成、贮藏的ChMDH、ChVHA基因的表达规律与MDH、VHA酶活性变化规律相似,成熟期两个基因表达量及其酶活性增加促进了苹果酸快速积累和贮藏。欧李果实ChME的表达量并不与其酶活性直接相关,在果实发育后期‘农大3号’ChME表达量持续增加与苹果酸的降解有一定关系。果实成熟前ChME、ChMDH基因表达与ME、MDH活性的不同是导致不同品种果实酸度差异的重要原因。