研究背景及目的:调节性T细胞(Regulatory T cells, Treg)在自身免疫耐受和免疫自稳中起着非常关键的作用,其在胸腺内发育成为一类独立的CD4~+T细胞亚群。许多研究结果都观察到表观遗传调控对于控制Treg细胞基因特别是Forkhead家族转录因子3(the forkhead/winged- helix protein 3, FOXP3)的表达起到很关键的作用。Treg细胞和普通的T细胞相比,FOXP3基因不同区域的DNA甲基化和特异性的组蛋白修饰方式是不同的。但是目前的研究主要还是集中在DNA的甲基化是如何调控Treg基因的表达,关于组蛋白修饰,特别是与启动子相关的H3K4me3修饰(trimethylated histone H3 lysine 4)和与增强子相关的H3K4me1修饰(monomethylated histone H3 lysine 4),对于Treg细胞基因表达的调节作用研究很少。因此,本研究拟采用ChIP-Seq的技术,绘制并比较Treg细胞和aTconv细胞H3K4me3和H3K4me1修饰的全基因组图谱,从而对H3K4me3和H3K4me1这两种修饰在Treg细胞基因表达中的调节作用进行了初步的探讨。实验方法:一、人CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞的体外扩增和纯化:1.人CD4~+CD25~+Treg细胞的分离和纯度检测:用磁珠分选(magnetic-activated cell-sorting, MACS)的方法从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中分离CD4~+CD25~+T细胞;用流式细胞术(flow cytometry, FCM)的方法检测分选后细胞的纯度;2.人CD4~+CD25~+Treg细胞的体外扩增与纯度检测:用Invitrogen公司人Treg细胞体外扩增试剂盒进行Treg细胞的体外扩增;用FCM的方法检测扩增过程中FOXP3~+细胞的纯度;3.扩增后细胞的抑制功能检测:扩增后细胞与CFSE(5-and-6 carboxy fluoresceindiacetate succinimidyl ester)标记的CD4~+CD25-T细胞不同比例混合(0:1, 1:1, 1:2, 1:4), FCM检测CD4~+CD25-T细胞的增殖情况;4.扩增后细胞进行流式细胞分选:用CD4、CD25和FOXP3三个标记对扩增后的细胞进行流式细胞分选(fluorescence activated cell sorting, FACS) ,分选出CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞和CD4~+CD25~+FOXP3-T(aTconv)细胞。二、H3K4me3和H3K4me1在人Treg细胞基因表达调控中的作用:1.染色质免疫共沉淀实验(chromatin immunoprecipitation, ChIP)及高通量测序前后已知位点的实时定量PCR(quantitative real-time PCR, QPCR)检测:用抗H3K4me3抗体和抗H3K4me1抗体及其阴性对照抗体IgG对扩增后的Treg细胞和aTconv细胞进行ChIP;用ChIP-QPCR的方法对选取的阳性位点进行检测,我们选取了部分与Treg细胞功能相关基因的启动子或者H3K4me1位点作为阳性位点,例如FOXP3,白介素2受体α(interleukin 2 receptor alpha, IL2RA),糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor, GITR),细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte -associated antigen-4, CTLA-4),趋化因子受体7(chemokine (C-Cmotif) receptor 7, CCR7)以及信号传导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)家族;2.ChIP样本的高通量测序(high-throughput sequencing)及生物信息学分析:将ChIP DNA样本送往深圳华大基因研究所,使用Solexa 1G Genome Analyzer高通量侧测序仪进行高通量测序;用比对软件SOAP(short oligonucleotide analysis package)将测序数据与人类基因组序列进行比对,获得唯一比对的reads;用MACS(Model-based Analysis for ChIP-Seq)方法进行全基因组peaks的扫描,获得H3K4me3 peaks和H3K4me1 peaks;3.Treg细胞和aTconv细胞的H3K4me3和H3K4me1修饰的全基因组图谱及其比较:人类基因组分为四个部分,即近端启动子区(proximal promoters)、外显子区(exons)、内含子区(introns)、基因间区(intergenic sequences),统计Peaks在这些区域分布的比例;通过生物信息学鉴定Treg细胞或者aTconv细胞之间共有的或者特异性的H3K4me3 peaks、H3K4me1 peaks、H3K4me3 proximal promoters以及proximal promoters相关基因;4.Treg细胞和aTconv细胞特异性或者共有基因的H3K4me3和H3K4me1修饰特征:选取与Treg细胞功能密切相关的基因,例如FOXP3, IL2RA, CTLA4、TNFRSF18、STAT家族和CCR7等,将ChIP-Seq数据在UCSC Genome Browser以图形化的方式展示,比较这些基因H3K4me3和H3K4me1的修饰特征;用QPCR的方法鉴定这些基因在这两类细胞之间的mRNA表达水平差异;5.Treg细胞和aTconv细胞特异性或者共有的H3K4me1位点的功能鉴定:运用双荧光素酶报告基因实验来证实候选的H3K4me1片段是否具有增强子的活性。实验结果:第一部分:人CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞的体外扩增和纯化1.MACS的方法从PBMC中分离了CD4~+CD25~+T细胞,通过流式细胞仪检测CD4~+CD25~+T细胞的纯度为93.7%;2.用Invitrogen公司商品化的人CD4~+CD25~+Treg细胞体外扩增试剂盒对MACS分选的细胞进行扩增,扩增70天后,细胞绝对数扩大了1000倍以上;但是在细胞扩增的整个过程中,我们通过CD4、CD25和FOXP3这三个标志进行Treg细胞纯度的检测,结果发现随着细胞绝对数的不断增加,CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞的纯度不断降低;3.CFSE标记的CD4~+CD25-T细胞与体外扩增的CD4~+CD25~+T细胞分别按1:0, 1:1, 2:1, 4:1比例混合,在CD3抗体与CD28抗体联合作用下,刺激7天后进行流式检测,发现扩增后的CD4~+CD25~+T细胞可以有效的抑制CD4~+CD25-T细胞的增殖; 4.用CD4、CD25和FOXP3这个三个标志,对扩增后细胞进行流式细胞分选,最终我们得到了2×106个纯度为99%的CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞以及1×107个纯度为99.4%的CD4~+CD25~+FOXP3-T细胞,我们将其分别命名为Treg细胞和活化的普通T细胞(active conventional T cells, aTconv)。第二部分:H3K4me3在人Treg细胞基因表达调控中作用1.高通量测序前通过对已知位点的QPCR检测,结果显示:已知基因的启动子区域,在Treg细胞和aTconv细胞中都会被H3K4me3高度修饰,而在阴性对照组IgG中,几乎不发生H3K4me3的富集;但是FOXP3基因的启动子区域例外,结果显示仅仅Treg细胞中会发生强烈的H3K4me3修饰,在aTconv细胞和阴性对照组中,没有富集。这些结果与理论是一致的,从而保证了样品的可靠性;2.ChIP样品送往深圳华大基因研究所进行高通量测序,经过生物信息学分析,得到了Treg细胞和aTconv细胞H3K4me3的全基因组图谱;3.运用生物信息学的方法首先从整体上比较了两样品的H3K4me3 peaks,发现:peaks的相关系数为0.92且共有的peaks数目为20784;然后比较了两类细胞之间的H3K4me3 proximal promoters,发现promoters的相关系数为0.83且有15508个共有的proximal promoters;最后比较了H3K4me3 proximal promoters相关基因,发现绝大部分的基因是共有基因,只有1220个Treg细胞特异性的基因,这其中就包括Treg细胞特异性的转录因子FOXP3;4.选取了与Treg细胞功能密切相关的基因,例如FOXP3, IL2RA, CTLA,肿瘤坏死因子受体超家族成员18(tumor necrosis factor receptor superfamily member 18, TNFRSF18), STAT家族和CCR7,通过UCSC Genome Browser图形化展示,发现:IL2RA, CTLA4, TNFRSF18和STATs这些基因的启动子区域,不管是在Treg细胞还是aTconv细胞,都发生了比较强烈的H3K4me3修饰。但是FOXP3和CCR7基因启动子区域,只有在Treg细胞才发生了强烈的H3K4me3修饰,而在aTconv细胞中却没有;mRNA的表达水平与H3K4me3在启动子区域的修饰程度一致。第三部分:H3K4me1在人Treg细胞基因表达调控中的作用1.高通量测序后通过对已知位点的QPCR检测,结果显示:在Treg细胞或者aTconv细胞的已知位点,会发生比较比较强烈的H3K4me1富集,但在阴性对照组中,则几乎不发生H3K4me1的富集,验证了数据的准确性;2.ChIP样品送往深圳华大基因研究所进行高通量测序,经过生物信息学分析,得到了Treg细胞和aTconv细胞H3K4me1的全基因组图谱;3.运用生物信息学的方法首先从整体上比较了两样品的H3K4me1 peaks,发现:peaks的相关系数为0.48且在总共115391个H3K4me1 peaks中只有8897个共有的peaks;4.选取了与Treg细胞功能密切相关的基因,例如FOXP3, IL2RA, CTLA及TNFRSF18,通过UCSC Genome Browser图形化展示发现,发现:Treg细胞和aTconv细胞之间,这些基因座上的H3K4me1修饰是差别明显的,但也存在少许的共有H3K4me1位点;5.双荧光素酶报告基因实验对H3K4me1位点进行功能鉴定,发现5个候选的H3K4me1位点中,只有2个在Jurkat细胞中有增强子的活性,而另外3个则没有明显的增强子活性;同时也发现,有2个Treg细胞和aTconv细胞共有的H3K4me1位点,在Jurkat细胞都显示了明显的增强子活性;6.通过生物信息学比较,发现:Treg细胞和aTconv细胞中,H3K4me1 peaks和H3K4me3 peaks的相关性分别为0.16和0.19;同时还发发现,在Treg细胞中,仅仅有5030个位点是同时被H3K4me1和H3K4me3修饰,而在aTconv细胞中,也仅仅有7063个位点被同时修饰。结论:1.本研究采用MACS~+FACS的方法得到了足够数量并且极高纯度的Treg细胞和aTconv细胞,从而为下一步实验奠定了非常坚实的基础,也为关于Treg细胞的其他方面研究建立了一个非常好的平台;2.我们首次绘制并比较了Treg细胞和aTconv细胞H3K4me3修饰的全基因组图谱,发现这两类细胞间H3K4me3修饰,特别是位于近端启动子区域的H3K4me3修饰,变化不大;但是在某些Treg细胞特异性或者高表达的基因(例如FOXP3和CCR7)的启动子上,H3K4me3修饰却只发生在Treg细胞上。QPCR结果显示mRNA的表达水平与H3K4m3在启动子上的修饰程度一致。这些结果提示我们:表观遗传可能通过调节启动子区域的H3K4me3修饰水平,进而调节Treg细胞基因的表达,换句话说H3K4me3可以通过调节基因启动子的活性进而调节Treg细胞基因的表达。3.我们首次绘制并比较了Treg细胞和aTconv细胞H3K4me1修饰的全基因组图谱。结果显示,全基因组范围内的H3K4me1修饰,在这两类细胞之间区别巨大;体外实验证明某些Treg细胞特异性的H3K4me1位点具有增强子的活性。这一点暗示H3K4me1标记的增强子可能是Treg细胞和aTconv细胞之间变化最大的转录调节元件,其对于Treg细胞特异性的基因表达调控起着至关重要的作用。换句话说,H3K4me1可以通过修饰增强子位点来调节Treg细胞基因的表达,其可能才是导致Treg细胞特异性的基因表达方式的主要原因。4.我们运用生物信息学的方法比较了Treg细胞和aTconv细胞中,H3K4me1 peaks和H3K4me3 peaks的相关性,发现绝大部分具有潜在调节功能的H3K4me1位点缺乏H3K4me3修饰。综上所述,本研究发现H3K4me3或H3K4me1可以通过修饰启动子或增强子来调节Treg细胞基因的表达,这对于Treg细胞的分化、谱系形成以及特异性的基因表达方式,起着非常重要的作用。