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目的:克隆粉尘螨Ⅴ类变应原Der f5基因并进行蛋白表达,分析其对哮喘小鼠特异性免疫治疗效果。方法:(1)已知der f5基因序列设计相应引物,提取粉尘螨总RNA,扩增der f5基因片段,RT-PCR法扩增后产物与克隆载体p UC57连接,转化入大肠杆菌DH-5α中,经酶切及测序鉴定获得p UC57-Der f5阳性菌株。提取质粒后用限制性内切酶NotⅠ和XhoⅠ进行双酶切,连接到原核表达载体p ET-28a(+)产生重组原核表达载体p ET28a(+)-Der f5,并用限制性内切酶进行酶切和测序验证。(2)将重组表达载体p ET28a(+)-Der f5转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中。用IPTG小剂量诱导表达der f5蛋白,优化条件进行大规模表达和纯化;(3)构建变应原der f5致敏的小鼠哮喘模型,用纯化的变应原der f5为疫苗对小鼠哮喘模型进行特异性免疫治疗。最后1次雾化吸入24 h后,收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)、分离血清,同时进行脾细胞培养。对BALF中白细胞总数和嗜酸性粒细胞(EOS)数目计数;ELISA法分别检测BALF中和脾细胞培养上清(SCSS)中的细胞因子IL-5、IL-17和IFN-γ的水平以及血清中变应原特异性Ig G1、Ig G2a和Ig E抗体的浓度。观察小鼠肺部组织HE染色后病理改变。结果:(1)成功构建了重组质粒p UC57-Der f5和原核表达重组载体p ET28a(+)-Der f5。经IPTG诱导含有p ET28a(+)-Der f5菌株后,SDS-PAGE和Western blot鉴定表明Der f5基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得良好的表达,同时完成了该蛋白的大规模纯化;(2)用Der f5变应原为疫苗对小鼠哮喘模型进行特异性免疫治疗后,与OVA组和哮喘组相比,SIT组小鼠肺部炎症显著减轻,BALF中白细胞总数、EOS显著降低(p<0.01);同时,BALF和SSCS中IL-5和IL-17以及血清抗原特异性Ig E、Ig G1抗体水平也明显降低(p<0.01),但IFN-γ含量和Ig G2a水平明显升高(p<0.01)。结论:成功获得了p ET28a(+)-Der f5原核表达载体,并进行了蛋白表达和纯化。粉尘螨Ⅴ类变应原Der f 5疫苗可有效改善小鼠变态反应性气道,有效抑制小鼠肺部过敏性炎症,为后续治疗过敏性哮喘提供一种新型候选疫苗。