前言:　　 阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种原发的中枢神经系统变性疾病，是老年期痴呆的最常见病因。随着全球人口老龄化的进程，AD的发病率也在逐年上升。AD临床表现为不可逆进行性发展的记忆减退、认知障碍及人格的改变等。神经细胞外老年斑(Senile plaque，SP)的大量沉积，神经细胞内神经原纤维缠结(Neurofirillary tangles，NFT)，以及海马皮层为主的选择性神经元大量丢失是AD的典型病理表现。目前AD的发病机制尚不完全清楚，β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)是老年斑的主要成分，Aβ的沉积被认为是AD发病过程的中心环节。 Aβ诱导神经毒性作用是多重复杂的，它通过触发细胞凋亡，氧化应激，钙失稳态，突触毒性，炎症反应等一系列级联反应，最终导致神经元丢失或功能障碍。因此Aβ的神经毒机制是多种因素导致AD发病的共同通路。当前依然缺乏治疗AD的特效药物，所以AD的防治现已成为全球老年病防治的热点。　　 ATP敏感性钾通道(ATP sensitive potassium channel，KATP)，是一组将细胞电活动与能量代谢偶联在一起的重要通道，可以调节细胞在不同生理病理状态下的细胞兴奋性和能量代谢。KATP可以分成2类:一是位于细胞膜上的KATP（sarcolemmal KATPchannel，sKATP）;二是位于线粒体内膜上的KATP(mitochondrialKATP channel, mitoKATP)。药理学研究证实激活mitoKATP是目前抗心肌缺血治疗的新靶点。mitoKATP通道在脑组织中广泛分布，其含量为心肌细胞的6倍多。近年来越来越多的证据表明mitoKATP开放剂对于神经系统疾病:脑缺血，阿尔茨海默病，癫痫等疾病中也有着重要的脑保护作用。它参与神经保护的机制仍不十分清楚:包括抗细胞凋亡，减少氧化应激损伤，抗兴奋性氨基酸毒性，减少细胞钙超载，调节线粒体容积，改善线粒体膜电位等等。KATP开放剂的种类繁多，因为它们的多种毒副作用限制了临床的应用。尼可地尔作为首个应用于临床的mitoKATP开放剂，被广泛用于心绞痛的治疗，已有大量的基础和临床研究证实尼可地尔抗心肌缺血的保护作用。Teshima等证实尼可地尔可以减少氧化应激损伤诱发的神经元凋亡。Goodman等证实mitoKATP开放剂二氮嗪可以保护体外培养的大鼠海马神经元抵抗氧化应激损伤和Aβ毒性损伤。最近有研究报道二氮嗪治疗可以减轻AD转基因小鼠的分子学，细胞病理学和行为学损伤。由此我们推测尼可地尔作为mitoKATP开放剂很可能是一个治疗AD的有潜力的神经保护药物。　　 本文以临床应用的mitoKATP开放剂尼可地尔为研究药物，建立高表达瑞典突变型淀粉样肽前体蛋白的神经母细胞瘤细胞作为AD细胞模型。研究mitoKATP开放剂尼可地尔对AD细胞模型细胞凋亡作用的影响，并观察尼可地尔对AD细胞模型细胞内氧化应激相关指标，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)活性的影响。并探讨尼可地尔对AD细胞模型凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax，Caspase-3的表达，APP代谢，Aβ的生成，以及细胞生存通路PI3K/Akt信号通路的影响，旨在为AD发病机制的的探索和神经保护药物的开发提供理论依据。　　 研究方法:　　 体外培养SH-SY5Y细胞，通过瞬时转染建立高表达瑞典突变型APP695基因的细胞模型并进行鉴定。细胞转染24小时后，各组进行不同终浓度的mitoKATP开放剂尼可地尔(0.1mmol/l，0.5mmol/l，1mmol/l)，KATP阻断剂格列本脲(10μmol/l)，尼可地尔(1mmol/l)+格列本脲（10μmol/l）共同处理24小时。各组采用MTT法检测细胞存活率，Annexin-V/PI双染色通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，Hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡形态学。Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax，Caspase-3以及APP695蛋白的表达。Realtime PCR检测APP695mRNA的水平，ELISA法检测细胞外液Aβ1-42水平。生化试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)的活性。通过PI3K抑制剂LY294002（10μmol/l）提前预处理1小时，Western blot检测Akt，p-Akt，GSK-3β，p-GSK-3β，CREB，p-CREB的蛋白表达，观察尼可地尔对AD细胞模型PI3K/Akt信号通路及下游蛋白GSK-3β，CREB的活化情况。　　 研究结果:　　 一、AD细胞模型的建立和鉴定　　 pcDNA3.1-sweAPP695质粒和空质粒pEGFPN1分别瞬时转染SH-SY5Y细胞，转染24h，48h，72h后分别收集各组细胞蛋白进行Western blot检测。结果显示:APP695sw质粒组在转染24h，48h和72h后的APP695蛋白表达均明显高于空质粒转染组(P＜0.05)，且有明显的时间依赖性(P＜0.05)。　　 转染24h，48h，72h后分别收集细胞培养液，采用ELISA试剂盒检测细胞外液Aβ1-42浓度。结果显示:APP695sw质粒组在转染24h，48h和72h后细胞外液Aβ1-42的水平均明显高于空质粒转染组(P＜0.05)，呈明显时间依赖性（P＜0.05）。　　 二、MTT法检测尼可地尔对AD细胞模型细胞生存率的影响　　 APPsw细胞无药物处理组较空质粒转染组相比，细胞生存率明显降低，分别为62±1.6％和98±5.0％（P＜0.05）;而尼可地尔处理组(0.1mmol/l，0.5mmol/l，1 mmol/l)较无药物处理组相比，细胞生存率明显升高，依次为72±1.8％，77±1.6％，87±2.9％，且有浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）;而KATP阻断剂格列本脲可以阻断这一保护效应(P＞0.05)。　　 三、Annexin-V/PI双染色检测细胞凋亡率　　 空质粒转染组仅有少量的细胞凋亡3.97±0.39％，APPsw细胞无药物处理组的细胞凋亡率明显增加28.13±1.00％(P＜0.05);尼可地尔处理组(0.1mmol/l，0.5mmol/l，1mmol/l)细胞凋亡率明显降低，分别为21.4±0.96％，17.66±0.89％，13.2±0.60％，且有浓度依赖性，差异有统计学意义(P＜0.05);而KATP阻断剂格列本脲可以阻断这一保护效应（P＞0.05）。　　 四、Hoechst33342染色观察细胞核形态的变化　　 空质粒转染组细胞核体积较大、较圆，表面光滑，细胞核发出弥散均匀的蓝色荧光。APPsw细胞组在正常细胞核之间可见到散在分布的凋亡细胞核:细胞核体积变小，皱缩，致密浓染或呈碎块状。尼可地尔处理组可以明显减少APPsw细胞的凋亡，与APPsw细胞无药物处理组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 五、尼可地尔对APPsw细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)水平的影响　　 与空质粒转染组相比，APPsw细胞无药物处理组脂质过氧化产物MDA明显升高，还原型谷胱甘肽GSH水平明显降低，总SOD水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。而尼可地尔处理组可以明显降低MDA的生成，而增加总SOD，GSH的水平，差异有统计学意义(P＜0.05);且KATP阻断剂格列本脲可以阻断上述保护效应(P＞0.05)。　　 六、尼可地尔对AD细胞模型凋亡相关蛋白的影响　　 Western blot结果显示:APPsw细胞无药物处理组凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达较空质粒转染组明显升高，抗凋亡蛋白Bcl-2明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。尼可地尔处理组可以升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达水平，差异有统计学意义(P＜0.05)，上述保护效应均能被KATP阻断剂格列本脲所抵消(P＞0.05)。　　 七、尼可地尔对AD细胞模型APP代谢的影响　　 Realtime PCR结果显示:APPsw细胞组APP695mRNA表达水平较空质粒转染组明显升高(P＜0.05)，尼可地尔处理组可以明显降低APP695mRNA的表达(P＜0.05)，格列本脲可以阻断这一效应(P＞0.05)。Western blot结果显示:APPsw细胞组APP695蛋白表达水平较空质粒转染组明显升高(P＜0.05)，尼可地尔处理组可以明显降低APP695蛋白的表达(P＜0.05)，格列本脲可以阻断这一效应(P＞0.05)。ELISA结果显示:APPsw细胞组细胞外液Aβ1-42的水平较空质粒转染组明显升高(P＜0.05)，尼可地尔处理组可以明显降低细胞外液Aβ1-42的分泌水平(P＜0.05)，这一效应同样可以被格列本脲所阻断(P＞0.05)。　　 八、尼可地尔对AD细胞模型PI3K/Akt信号通路的影响　　 Western blot结果显示:尼可地尔处理组p-Akt的表达水平明显较APPsw细胞无药物处理组升高，而总的Akt水平没有变化，LY294002预处理可以阻断这一效应，表明尼可地尔能够促进Akt的活化。尼可地尔可以明显上调p-Ser133-CREB蛋白和p-GSK-3β蛋白的表达水平，并且尼可地尔对CREB的激活效应和对GSK-3β的抑制效应均可以被LY294002预处理所抵消。　　 结论:　　 1、成功建立了能够高表达APP695蛋白的AD细胞模型(APPsw细胞)，此细胞能够分泌高水平的Aβ1-42。　　 2、尼可地尔可以增加APPsw细胞的细胞活力，并可以减少APPsw细胞的细胞凋亡率，均具有剂量依赖性。　　 3、尼可地尔可能通过抑制促凋亡蛋白Bax，Caspase-3的表达，升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来发挥抗细胞凋亡的作用。　　 4、尼可地尔可以提高APPsw细胞的总SOD活性，增加GSH水平，降低MDA水平，发挥抗氧化作用。　　 5、尼可地尔可以降低APPsw细胞APP695mRNA和APP695蛋白的表达，同时减少Aβ1-42的生成。　　 6、通过激活PI3K/Akt信号通路从而使GSK-3β失活，并能激活下游蛋白CREB可能是尼可地尔参与AD细胞模型的神经保护机制。