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Ⅰ自然杀伤细胞在实验性自身免疫性重症肌无力中的免疫调节作用研究背景重症肌无力(myastheniagravis,MG)是一种抗体介导的自身免疫疾病。目前认为,重症肌无力的主要发病机制之一是抗乙酰胆碱受体抗体与神经肌肉接头突触后膜的乙酰胆碱受体结合,阻断了神经肌肉接头突触传导,导致肌无力产生。通过主动免疫而建立大鼠实验性自身免疫性重症肌无力模型是研究重症肌无力的有效手段。滤泡辅助T细胞(follicular helperT cells,Tfh细胞)是一种新近发现的CD4+T细胞亚群。其高表达C-X-C趋化因子受体5(C-X-C chemokine receptortype 5,CXCR5)、诱导性共刺激分子(inducible co-stimulator,ICOS)、程序性死亡受体1(programmed cell death 1,PD-1)等分子,在B细胞增殖和分化、抗体亚型转换、抗体亲和力成熟过程中发挥至关重要的作用。研究显示,Tfh细胞在重症肌无力疾病的发生和发展中发挥重要作用。自然杀伤细胞(naturalkillercells,NK细胞)是一类具有天然细胞杀伤功能的淋巴细胞,是固有免疫细胞的一种。研究显示,NK细胞不仅具有抗肿瘤、抗病毒功能,还在自身免疫疾病中发挥关键作用。然而,NK细胞在重症肌无力中的作用及机制尚不清楚;此外,NK细胞对Tfh细胞的免疫调节作用也鲜有报道。研究目的本实验旨在通过体内及体外实验研究NK细胞在实验性自身免疫性重症肌无力中的作用,探讨NK细胞对Tfh细胞的免疫调节作用及机制,为重症肌无力的治疗提供新的靶点和策略。研究方法1.本研究通过向Lewis大鼠尾根部皮下免疫大鼠乙酰胆碱受体α亚基肽段(R97-116),诱导 EAMG 模型,并将模型鼠随机分成对照组和 NK 细胞组,分别经尾静脉注射PBS和大鼠脾脏来源的NK细胞。初次免疫后,采用盲法监测模型鼠体重和肌无力临床评分。初次免疫后第46天,处死模型鼠,收集血清和脾脏,制备脾脏单个核细胞悬液。2.ELISA法检测血清中抗R97-116肽段抗体水平、抗体亚型、抗体亲和力。3.流式细胞术分析脾脏Tfh细胞及其亚型、调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)、生发中心B细胞、树突状细胞及自然杀伤T细胞(naturalkillerT cells,NKT细胞)的比例。4.将NK细胞与脾脏单个核细胞或CD3+T细胞共培养,流式细胞术分析T细胞、Tfh细胞的数量、比例和细胞凋亡情况。5.采用IL-15处理体外培养的脾脏单个核细胞(IL-15具有激活NK细胞的功能),流式细胞术分析T细胞、Tfh细胞的数量、比例和细胞凋亡情况,分析B细胞增殖情况。研究结果1.与对照组相比,静脉注射大鼠脾脏来源的NK细胞,能够显著缓解EAMG临床症状。初次免疫后第38天、第40天、第42天、第44天、第46天,NK细胞组EAMG大鼠临床症状明显减轻(p<0.05)。2.ELISA实验结果显示,与对照组相比,NK细胞组大鼠血清内抗R97-116 IgG2a抗体水平明显降低(p<0.01),但总IgG抗体、IgG1抗体、IgG2b抗体的水平无明显变化。此外,NK细胞组大鼠血清抗R97-116IgG抗体的亲和力有降低趋势(p=0.09)。3.流式细胞术分析显示,NK细胞组EAMG大鼠脾脏生发中心B细胞比例明显降低(p<0.01),而记忆性B细胞的比例无明显变化。与此同时,NK细胞能够降低EAMG大鼠脾脏Tfh细胞的比例(p<0.05),但对Tfh细胞亚型无明显影响。而且,静脉注射NK细胞对脾脏Treg、树突状细胞及NKT细胞的比例无影响。4.IL-15处理体外培养的脾脏单个核细胞后,脾脏单个核细胞中NK细胞的比例显著增加,而Tfh细胞的比例降低,T细胞凋亡增加。此外,IL-15能够抑制单个核细胞中B细胞的增殖,这可能与其抑制Tfh细胞相关。5.体外共培养实验研究显示,与脾脏单个核细胞单独培养(对照组)相比,当脾脏单个核细胞与NK细胞共培养时,其Tfh细胞数量降低。此外,与CD3+T细胞单独培养(对照组)相比,当CD3+T细胞与NK细胞共培养时,其Tfh细胞的比例降低,且Tfh细胞的凋亡增加。研究结论1.NK细胞能够通过降低Tfh细胞比例,抑制生发中心B细胞分化,降低EAMG大鼠血清抗体水平,缓解EAMG大鼠临床症状。2.NK细胞通过其细胞毒作用,诱导Tfh细胞凋亡,抑制Tfh细胞分化,降低Tfh细胞比例。Ⅱ GXCR5~+NK细胞及GXGR5~-NK细胞的表型、分布及免疫调节作用研究背景自然杀伤细胞(naturalkillercells,NK细胞)是一类具有天然细胞杀伤功能的淋巴细胞,是固有免疫细胞的一种。研究显示,NK细胞不仅具有抗肿瘤、抗病毒功能,还在自身免疫疾病中发挥关键作用。NK细胞是一种异质性的淋巴细胞群体,包括多种细胞亚群。不同NK细胞亚群具有不同的表型和功能,发挥不同的免疫调节作用。C-X-C 趋化因子受体 5(C-X-C chemokine receptortype 5,CXCR5)是 C-X-C家族趋化因子受体的一员,其配体是C-X-C趋化因子配体13(C-X-C chemokine ligand 13,CXCL13)。CXCR5 表达于 B 细胞、滤泡辅助 T 细胞(follicularhelper T cells,Tfh细胞)、部分CD8+T细胞及自然杀伤T细胞(natural killer T cells,NKT细胞)。淋巴滤泡内的基质细胞能够分泌大量的CXCL13,趋化表达CXCR5的细胞迁移至淋巴滤泡内。研究显示,Tfh细胞、CD8+CXCR5+T细胞及CXCR5+NKT细胞均具有调节生发中心免疫反应,辅助B细胞抗体产生的功能。论文第一部分的研究结果显示,NK细胞具有调节生发中心B细胞及抗体分泌的能力。而NK细胞是否表达CXCR5及CXCR5+NK细胞的功能尚不清楚。研究目的本实验旨在探讨CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞的表型、分布、迁移及功能差别,探讨CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞对Tfh细胞的免疫调节作用,揭示不同NK细胞在实验性自身免疫性重症肌无力中的作用,为重症肌无力的治疗提供新的靶点和策略。研究方法1.提取Lewis大鼠外周血、脾脏、淋巴结,制备单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)悬液,流式细胞术分析大鼠外周血、脾脏、淋巴结CXCR5+NK细胞的比例。2.免疫荧光染色,检测NK细胞在B细胞区及生发中心的分布。3.分选的NK细胞、CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞,CFSE标记后注射至大鼠体内,检测NK细胞、CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞体内迁移能力。4.流式细胞术分析大鼠CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞表面诱导性共刺激分子(inducible co-stimulator,ICOS)、CD25、CD27 的表达水平,分析CXCR5-NK 细胞和 CXCR5+NK 细胞分泌干扰素γ(interferonγ,IFN-γ)、白介素 17(interleukin 17,IL-17)的能力,比较 CXCR5-NK 细胞和 CXCR5+NK细胞表型差异。5.诱导实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune my asthenia gravis,EAMG)及实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)模型,线性回归分析上述大鼠脾脏或淋巴结CXCR5+NK细胞与Tfh细胞及生发中心B细胞的相关性。6.分选CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞,将脾脏单个核细胞或CD3+T细胞分别与CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞及Tfh细胞的数量及比例,分析Tfh细胞表面ICOS的表达水平。研究结果1.大鼠外周血、脾脏、淋巴结NK细胞均可以分成CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞。其中,CXCR5+NK细胞分别占外周血、脾脏、淋巴结NK细胞的0.63±0.03%、2.44±0.17%与 9.75 ± 0.96%。2.免疫荧光及体内示踪实验显示,大鼠脾脏B细胞区存在NK细胞;与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞迁移至B细胞区的能力更强。3.与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞ICOS及IL-17的表达水平增加、CD27的表达水平降低,而二者CD25及IFN-γ表达水平无明显差异。此外,CXCR5+NK细胞的体积和颗粒度要高于CXCR5-NK细胞。4.线性回归分析表明,EAMG大鼠脾脏CXCR5+NK细胞的比例与Tfh细胞的比例及生发中心B细胞的比例呈正相关,而CXCR5-NK细胞与CXCR5+NK细胞的比值与Tfh细胞的比例及生发中心B细胞的比例呈负相关。在EAN大鼠模型中也观察到相似结果。5.体外实验显示,当CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞与脾脏单个核细胞共培养时,CXCR5-NK细胞能够抑制脾脏单个核细胞中CD4+T细胞及Tfh细胞的数量,而CXCR5+NK细胞对MNCs中CD4+T细胞及Tfh细胞的抑制作用不明显。当CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞与脾脏CD3+T细胞共培养时,CXCR5-NK细胞能够抑制CD4+T细胞中Tfh细胞的比例,而CXCR5+NK细胞对其作用不明显;并且,与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞能够促进Tfh细胞表面ICOS的表达,增加CD4+CXCR5+细胞中ICOS阳性的比例。研究结论1.大鼠外周血、脾脏、淋巴结NK细胞可以分成CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞。2.CXCR5-NK细胞与CXCR5+NK细胞具有不同表面分子和细胞因子分泌。3.CXCR5-NK细胞能够抑制Tfh细胞的分化;CXCR5+NK细胞能够促进Tfh细胞表面ICOS的表达,促进Tfh细胞的分化和功能。