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黄病毒是黄病毒科黄病毒属病毒的统称,为单链正义RNA病毒,是一类重要的引起人类疾病的虫媒病毒,主要包括西尼罗病毒、黄热病毒、登革病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒和蜱传脑炎病毒等,在世界范围内分布广泛,严重危害人类的生命健康。目前,大多数黄病毒缺乏有效的疫苗和抗病毒药物,并且蚊虫和蜱虫是黄病毒的主要传播媒介,进一步增大了控制病毒传播及疾病预防的难度。因此,建立有效的抗病毒药物筛选平台、研究黄病毒的致病机制具有重要意义。鄂木斯克出血热病毒（Omsk hemorrhagic fever virus,OHFV）是一种由蜱虫传播的生物安全四级（Biosafety level 4,BSL4）的病原体,主要引起发热、头痛、咳嗽、肌痛、出血等症状,有时出现脑膜炎并伴有神经系统损害,严重威胁人类健康。在生物安全等级四级实验室进行病毒学操作极大限制了OHFV的研究。目前,针对OHFV病毒的感染,尚无商业化的疫苗和抗病毒药物。在本论文中,利用OHFV感染性克隆,我们构建了NS1基因缺失的OHFV复制缺陷病毒（OHFV-?NS1）和复制缺陷的Gaussia荧光素酶（Gluc）报告病毒（OHFV-?NS1-Gluc）。这两种缺陷病毒只能在稳定表达NS1的BHK-21细胞系(BHK-21NS1)中复制增殖,在野生型的BHK-21细胞中不能产毒,同时Gluc报告基因的表达可有效表征病毒的复制。利用OHFV-?NS1-Gluc报告病毒,我们建立了基于96孔板的高通量药物筛选方法。OHFV复制缺陷病毒的成功构建为我们在BSL2实验室研究OHFV的复制机制、致病机理及高通量药物筛选提供了平台。sfRNA（subgenomic flavivirus RNA,sfRNA）是近年新发现的黄病毒重要的毒力因子之一,sfRNA是由宿主5?-3?核酸外切酶XRN1不完全切割病毒基因组RNA形成的非编码RNA。sfRNA可参与细胞内的I型干扰素反应和RNAi等,影响病毒的致病性。前期文献表明,sfRNA的产生是由3?UTR保守的茎环结构（SLII/SLIV）和哑铃结构（DB1/DB2）阻止XRN1的切割而形成。本论文研究发现了一组新的位于黄病毒3?UTR的二级结构可影响sfRNA的产生。我们发现实验室已有的两株西尼罗病毒（WNV和WNVa）对小鼠的致病性与sfRNA产生具有相关性。通过全基因组序列比对、感染性克隆突变验证、小鼠毒力实验以及sfRNA检测等一系列实验,证明病毒基因组的10577位点是影响sfRNA1产生及病毒致病性的关键位点。分析发现10577位于3?UTR的RCS3区,我们利用突变的重组病毒证明了RCS3序列的缺失影响病毒sfRNA1的产生。RCS3环区及茎区的一系列突变表明:RCS3的茎区配对是sfRNA1产生所必需的,而环区序列不是sfRNA1产生的必要条件。通过黄病毒3?UTR序列分析,我们发现CS序列在不同黄病毒中均比较保守,继而验证了WNV CS3、RCS2和CS2序列缺失的病毒分别影响sfRNA2/3/4条带的产生。通过多位点突变,我们也验证了WNV CS3的茎区配对是sfRNA2产生的必要条件。我们在ZIKV及DENV2病毒中也进一步验证了RCS3和CS3保守结构影响sfRNA的产生。我们首次系统验证了黄病毒属不同种病毒的CS保守序列对sfRNA的产生有影响,为黄病毒减毒疫苗的研发和治疗提供了新的位点。