肾脏不仅参与代谢废物的排泄,还具有分泌激素,维持水电解质以及酸碱平衡等重要功能。因此,肾脏功能发生异常必然导致其他重要器官的代谢和功能也随之改变。有研究表明:当肾脏功能受损时,其邻近和远端器官如心、肺、肝、肠和脑等的功能也会严重受损。肾缺血再灌注损伤(Renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是目前临床上经常遇到的一个棘手问题,多见于高血压、肾外科手术期间等,它也是导致肾移植术后功能恢复延迟、病人愈后较差甚至肾功能衰竭的重要因素。有研究表明:氧化应激是导致RIRI发生的主要病理机制之一。缺血再灌注时肾脏处于高度氧化应激状态,会有大量ROS产生。ROS包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH-)和过氧化氢(H2O2)等;ROS化学性质非常活泼,可以与细胞内的蛋白质、DNA和脂类等生物大分子发生过氧化反应,从而影响细胞功能,甚至引起细胞和组织死亡。Peroxiredoxin(Prx)蛋白是近几年发现的一类过氧化物酶系,广泛存在于各种原核和真核生物细胞中。Prx6是其家族成员之一,它在多种组织表达,其中肺和脑表达最多。研究表明,Prx6具有谷胱甘肽过氧化物酶的生物活性,其功能主要是负责还原H2O2和磷脂过氧化物等。脑组织是机体内对氧含量高度敏感的器官,当肾脏缺血再灌注损伤发生后,脑组织是否也会受到氧化应激损伤?抗氧化酶Prx6的基因和蛋白表达水平如何改变?未见报道。本研究通过采用无损伤动脉夹钳夹肾动脉法建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型。24小时后观察脑组织内MDA含量,Prx6基因水平和蛋白水平的表达变化,探讨肾脏缺血再灌注损伤时脑组织的过氧化损伤程度,Prx6在缺血再灌注损伤过程中的抗氧化作用,为防治RIRI引起的脑组织损伤提供一条新思路。目的:观察大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型脑内的氧化应激状态和抗氧化酶Prx6基因和蛋白水平的表达变化,探讨Prx6在RIRI诱发的脑过氧化损伤中的作用。方法:1肾脏缺血再灌注损伤模型的制备及取材雄性Wister大鼠12只,体重200±10 g,购于河北医科大学实验动物中心,随机分为对照组(Control)和肾脏缺血再灌注损伤组(RIRI),每组各6只。用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),参照余晓东等人的方法制备肾脏缺血再灌注损伤模型。RIRI组大鼠开腹后暴露其双侧肾脏,先切除右肾,然后钝性分离左肾动脉,在靠近肾门处用无创动脉夹夹闭左肾动脉,观察肾脏由鲜红色逐渐变为暗红色。45mins后松开动脉夹,恢复血液供应,肉眼可见肾动脉充盈,肾脏由暗红色迅速变为鲜红色,表明再灌注成功。对照组大鼠开腹后只切除右肾,分离左肾动脉,但不夹闭左肾动脉。24小时后收集血液,3000rpm离心10min,分离血清用于血清肌酐(Serum Creatinine,SCr)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)浓度测定;处死大鼠取肾脏和脑,将肾脏于4%多聚甲醛中固定进行HE染色,观察肾脏的形态学改变。将脑组织置于液氮中用于Prx6m RNA和蛋白水平测定以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量测定。2测定指标及方法2.1血清SCr和BUN水平测定血清SCr浓度采用苦味酸法测定;血清BUN浓度采用酶偶联速率法测定。2.2 HE染色观察大鼠肾脏的形态结构肾脏组织经常规脱水、透明,石蜡包埋后,切片厚约5μm,苏木精伊红染色,日本产Olympus光学显微镜下观察肾脏的形态变化并进行图象分析。2.3大鼠脑组织MDA含量测定将从-70℃冰箱中取出的脑组织按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液,PH7.4,1mmol/L盐酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巯基乙醇),冰浴中匀浆,匀浆液4000rpm 4℃离心20min,取上清即制成10%脑组织匀浆,脑组织匀浆内MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒测定。2.4大鼠脑组织Prx6 m RNA水平测定用TRIzol法提取脑内总RNA。约3μg总RNA反转录成c DNA。以GAPDH为内对照,进行RT-PCR。分别以Prx6的扩增产物与GAPDH灰度值之比表示目的基因的相对表达量2.5大鼠脑组织Prx6蛋白水平测定采用Western blot法测定大鼠脑组织Prx6蛋白水平。将大鼠脑组织制成匀浆,离心后取上清。用改良Lowry法进行蛋白总量测定.电泳的蛋白上样量为60ug.经过转膜和封闭处理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx6抗体,室温静置过夜。再加入荧光标记的抗兔Ig G抗体.在双色红外线成像系统扫描照相并进行图像数值分析。结果:1大鼠肾组织的形态学改变光学显微镜下可见正常组大鼠肾血管球、肾小囊、近曲、远曲小管及集合管形态结构清晰规整。而RIRI组大鼠可见肾血管球萎缩,体积变小;肾小囊腔扩张;肾小管管腔明显扩张,个别近曲小管上皮细胞水肿,胞浆疏松化;肾间质水肿,肾小管间隙扩大;集合管出现管腔扩张、上皮水肿等改变。2血清SCr水平Con组大鼠血清中SCr的浓度为103.444±8.465μmol/L,而RIRI组血清SCr的浓度为131.153±17.814μmol/L。RIRI组大鼠血清SCr浓度明显高于Con组(P<0.05)。3血清BUN水平Con组大鼠血清BUN的浓度为4.462±0.541 mmol/L,而RIRI组血清BUN的浓度为13.685±4.397 mmol/L。RIRI组大鼠血清BUN的浓度明显高于Con组(P<0.05)。4脑匀浆内MDA的含量Con组大鼠脑匀浆内的MDA含量为7.67±1.77mmol/g,而RIRI组脑匀浆内的MDA含量为11.67±2.33 mmol/g。RIRI组大鼠脑匀浆内的MDA含量明显高于Con组(P<0.01)。5脑组织Prx6 m RNA的相对表达量采用RT-PCR的方法测定大鼠脑组织内Prx6 m RNA的相对表达量。Con组脑组织内Prx6 m RNA的相对表达量为0.69±0.16,RIRI脑组织内Prx6 m RNA的相对表达量为1.08±0.19,RIRI组大鼠脑组织内Prx6m RNA水平明显高于Con组(P<0.01)。说明RIRI组大鼠脑组织内Prx6的基因表达水平升高。6大鼠脑组织Prx6蛋白水平Con组大鼠脑组织内Prx6的蛋白表达水平为0.73±0.13,RIRI组大鼠脑组织内Prx6的蛋白表达水平为1.12±0.19。RIRI组Prx6蛋白水平明显高于对照组(P<0.01)。说明RIRI组大鼠脑组织内Prx6的蛋白表达水平升高。结论:1切除右肾后在靠近肾门处用无创动脉夹夹闭左肾动脉可成功建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型。2肾脏缺血再灌注损伤可使远端器官脑组织遭受氧化应激损伤,同时抗氧化酶Prx6的基因和蛋白表达水平明显增强。提示Prx6可能参与了肾脏缺血再灌注所诱发的脑组织内氧化应激反应,对脑组织具有保护作用。