不同倍性鲫鲤gnih/gnihr3基因克隆及表达研究

来源 :湖南师范大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:HuSiYou
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红鲫(Carassius auratus red var.)(2n=100,♀)与鲤鱼(Cyprinus carpio L.)(2n=100,♂)通过远缘杂交和遗传选育获得了两性可育的异源四倍体鲫鲤(4n=200,简称为4nAT)。以雄性改良4nAT为父本,二倍体红鲫为母本,通过染色体倍性操作技术获得了异源三倍体鲫(湘云鲫2号)。不育的湘云鲫2号为研究鱼类性腺发育调控提供了很好的实验材料。促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)已经在鸟类、哺乳类动物中被证实为一种负调控生殖轴的下丘脑神经肽,GnIH与其受体(gonadotropin-inhibitory hormone receptor,GnIHR)结合,共同抑制促性腺激素(gonadotropin hormone,GTH)的合成;目前关于Gn IH/GnIHR系统的表达及作用机制在鱼类中的研究较少。本文以可育二倍体红鲫和不育三倍体湘云鲫2号为研究对象,对gnih和gnihr3基因进行了分子克隆,并采用实时荧光定量PCR方法(qPCR)及组织原位杂交技术,对gnih和gnihr3在红鲫及湘云鲫2号中的表达差异进行了研究,为鱼类生殖生理学研究及繁殖育种提供理论依据。主要研究结果如下:1.红鲫和湘云鲫2号gnih/gnihr3基因克隆及序列分析本研究获得的红鲫和湘云鲫2号gnih基因的cDNA全长均为765bp,其中5’非编码区(untranslated region,UTR)为27bp,3’UTR为144bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为594bp,编码197个氨基酸。获得的红鲫gnihr3基因的cDNA全长为1678bp,其中5’UTR为130bp,3’UTR为186bp,ORF为1362bp,编码453个氨基酸;获得的湘云鲫2号gnihr3基因的全长为1670bp,其中5’UTR为130bp,3’UTR为178bp,ORF为1362bp,编码453个氨基酸。红鲫和湘云鲫2号GnIH的氨基酸序列均含有Gn IH肽典型的LPXRF(X=L or Q)标志,GnIHR3为含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体。氨基酸序列多重比对及进化树分析结果显示,红鲫和湘云鲫2号Gn IH/GnIHR3蛋白与其它鱼类Gn IH/GnIHR3蛋白同源性很高,进化关系较亲密;与鸟类及哺乳类GnIH/Gn IHR3蛋白进化距离较远。2.gnih/gnihr3基因在红鲫和湘云鲫2号的组织差异表达研究利用qPCR技术对两种鱼(♀、♂)共32个组织样本中gnih/gnihr3基因mRNA表达水平进行了检测,结果表明:(1)gnih基因在两种鱼的下丘脑中表达最高,在雌雄红鲫下丘脑中的表达没有显著差异;而gnih基因在湘云鲫2号雌鱼下丘脑中的表达水平显著高于雄鱼。(2)gnihr3基因在雌雄红鲫的下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)都有明显表达,特别是在精巢中表达非常高;而gnihr3基因在雌雄湘云鲫2号的性腺中高表达。由此可见,gnih主要存在于下丘脑,与广泛分布在HPG轴的受体结合,通过多条途径起作用。3.gnih/gnihr3基因在红鲫和湘云鲫2号的生殖轴差异表达研究利用qPCR技术对gnih/gnihr3基因在雌性二倍体红鲫和三倍体湘云鲫2号生殖轴表达进行了比较研究,研究结果表明:(1)gnih基因在红鲫下丘脑中的表达水平高于湘云鲫2号,但在两种鱼的卵巢和垂体中的表达水平较低,且无显著差异;(2)gnihr3基因在红鲫下丘脑和垂体中的表达水平高于湘云鲫2号,相反,gnihr3基因在红鲫卵巢中的表达水平低于湘云鲫2号。已有研究表明,gnrh2在非繁殖期湘云鲫脑中的表达水平比红鲫高,这可能与这一时期异源三倍体鲫gnih及其受体表达水平较低有关。4.gnih/gnihr3基因在红鲫和湘云鲫2号的组织定位利用组织原位杂交技术,研究了gnih/gnihr3基因在红鲫和湘云鲫2号的脑和垂体中的定位情况。gnih基因在红鲫和湘云鲫2号脑中主要分布在Dc、Dld、Dd、Npp、Npo、NLT区,且ghih在湘云鲫2号的杂交信号比红鲫弱;gnihr3基因主要在红鲫和湘云鲫2号垂体的PPD、RPD区,NH和PI区杂交信号较弱,且gnihr3基因在湘云鲫2号杂交信号比红鲫弱得多。
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