日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是人病毒性脑炎的主要病原。JEV可引起严重中枢神经系统损伤的传染病,且病死率较高,JEV同时也是马致死性脑炎的主要病原,还会导致任娠母猪流产、死胎、产弱仔和公猪的睾丸炎以及少数仔猪出现神经症状。JEV是一种自然疫源性病原,自然界中大部分脊椎动物都是其易感宿主,并主要在蚊子和猪之间传播,其中三带喙库蚊是其主要的传播媒介,猪是其主要的贮存和增殖宿主,鸟类也可参与其扩增功能并在环境中参与病毒的长距离传播。JEV是一种单股正链的RNA病毒,是黄病毒属JE血清群的原型病毒,其基因组编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。在病毒蛋白翻译过程中,JEV NS2A基因上的七联滑动体和下游的假结体结构会导致核糖体读码框的-1位移码,进而产生一个NS1衍生蛋白,NS1’蛋白。初步研究表明NS1’蛋白可能与病毒的神经嗜性有关。本研究利用反向遗传技术验证了NS2A基因的第66位核苷酸是JEV表达NS1’蛋白的关键位点之一,同时阐明了NS1’蛋白不能显著增强JE疫苗弱毒株的神经毒力,论证了分泌型NS1’蛋白可以作为检测野毒感染的生物标记。此外,本研究还发现NS1’蛋白能够抑制宿主的IFN-β信号通路的转导。主要研究内容为以下四个部分:1.日本脑炎病毒E279对病毒蚀斑形态和神经毒力的作用研究乙型脑炎是一种由日本脑炎病毒引起的,广泛流行于亚洲各个地区的病毒性脑炎。目前还没有特异性针对乙型脑炎的治疗药物,主动免疫是在人群和易感动物中预防JEV感染的最有效的方法。本研究对商品化的猪乙型脑炎和人乙型脑炎疫苗弱毒株进行评估。结果显示所有商品化疫苗均达到生产要求,JEV RNA拷贝数和病毒滴度均大于105每头份。但是蚀斑形态观察发现四株疫苗的蚀斑大小存在明显差异,两株猪乙型脑炎疫苗弱毒株在BHK-21细胞上蚀斑形态明显偏小。全基因序列分析显示突变主要发生在5’非编码区和E基因,并检测到了几个显性突变位点,而两株猪用疫苗弱毒株仅在基因组1813位有一个共同的显性突变。全基因测序峰图分析发现几个核苷酸位点存在特异性的套峰,说明所检测的病毒在这些位点存在核苷酸的不完全置换。对两株猪用疫苗株的氨基酸序列进行分析,结果显示在E蛋白的铰链区发生了关键位点的突变。通过对疫苗株进行蚀斑纯化,全基因分析以及疫苗回归实验,阐明了JEV的E279由原来的蛋氨酸突变为赖氨酸可以导致病毒在BHK-21细胞上蚀斑形态的变小,论证了在BHK-21细胞上能够显著增加子代病毒的含量。乳鼠攻毒实验表明该位点的突变能够显著增强疫苗株对两周龄乳鼠的神经毒力。本研究发现JE疫苗株在病毒传代过程中容易发生关键位点的突变,为疫苗的安全生产和评估提供了有价值的信息。2.JEV NS1’蛋白在疫苗弱毒株的产生机制及其在病毒感染中的作用研究本研究首先建立了JEV弱毒株SA14-14-2的反向遗传体系,并利用反向遗传技术验证了JE血清群病毒表达NS1’蛋白的分子机制。NS1’蛋白是NS1蛋白在C端延伸52个氨基酸的衍生蛋白,是由于病毒在翻译过程中发生读码框的-1位移码引起的。JE疫苗弱毒株由于基因突变而废除NS1’蛋白的表达。本文通过回复突变NS2A基因的A66G可以恢复病毒NS2A基因的假结体二级结构,促成了读码框-1位移码的发生,并导致NS1’蛋白的表达。但是NS1’蛋白在BHK-21细胞上对病毒的复制效率几乎不产生影响,动物实验表明NS1’蛋白不能显著增强JEV弱毒株SA14-14-2的神经毒力。然而,相对于不表达NS1’蛋白的病毒(rSA14-14-2),表达NS1’蛋白的病毒(rA66G)能够诱导机体产生更高的获得性免疫应答。此外,NS1’蛋白可以从病毒感染细胞中分泌出来,在受感染动物的血浆中和受感染细胞培养的上清中均能检测到分泌型NS1’蛋白,且NS1’蛋白只以二聚体的形式分泌到受感染细胞外。通过半定量分析发现,分泌到细胞外NS1’蛋白的数量与分泌的病毒粒子呈正相关性。虽然NS1’蛋白与病毒的毒力没有明显相关性,但是相比较JE疫苗弱毒株不表达NS1’蛋白,大部分的流行毒株可以表达NS1’蛋白。因此,分泌型NS1’蛋白可以代替病毒血症作为生物标记区分野毒感染和疫苗接种。3.体外模拟核糖体移码机制及NS1’蛋白的亚细胞分布特征NS1’蛋白是NS1蛋白在C端延伸52个氨基酸的衍生蛋白,是由病毒在翻译过程中发生读码框的-1位移码引起的。本研究通过体外模拟JE血清群病毒核糖体-1位移码机制构建了NS1’蛋白真核表达质粒。并应用真核质粒瞬时转染BHK-21细胞,在转染12h后,就能检测到NS1’蛋白的表达。在转染的早期,NS1’蛋白的表达存在时间依赖关系。真核表达的NS1’蛋白也具有跨膜分泌的特性,也能够形成二聚体的表现形式。对于真核表达的NS1’蛋白进行亚细胞定位发现NS1’蛋白均匀分布于BHK-21细胞的胞浆中,与NS1蛋白在BHK-21细胞内的分布没有明显的差异。4.JEV NS1’蛋白对宿主IFN-β信号通路转导的影响本研究通过双报告基因系统分析JEV NS1’蛋白对IFN-β启动子活性的影响。首先,构建了五个IFN-β启动子活性域测试质粒,并在PK15细胞上检测其基础活性和对POLY(I:C)刺激的反应性。测试结果显示,缺失IFN-β启动子活性域Ⅰ/Ⅲ和Ⅱ的两个测试质粒是失活性缺失,其几乎不存在基础活性,对POLY(I:C)刺激的反应性较低。而未缺失IFN-β启动子活性域或缺失活性域Ⅳ,以及串联4个活性域Ⅰ/Ⅲ的测试质粒均有较高的基础活性,且对POLY(I:C)刺激具有良好的反应性。通过与测试质粒共转染PK-15细胞,发现NS1’蛋白能够抑制POLY(I:C)刺激后IFN-β启动子活性。并对其基础活性也能产生一定的抑制作用。此外,NS1’蛋白几乎不能抑制真核表达的IRF7刺激后IFN-β启动子活性。通过间接免疫荧光实验证明了NS1’蛋白在PK-15细胞上能够有效抑制POLY(I:C)刺激后NF-κB的入核作用。通过病毒感染模型,阐明了在干扰素应答的宿主细胞内,NS1’蛋白能够有效增加JEV的mRNA水平,并在感染早期抑制IFN-β的mRNA水平。通过免疫共沉淀和质谱分析发现在干扰素应答的宿主细胞内,NS1’蛋白可能与热应急蛋白、Vimentin和TRIM21发生相互作用,进而抑制宿主的先天性免疫反应。5.鸭坦布苏病毒流行株的全基因特征研究鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)是一种可引起鸭产蛋量下降、采食量锐减,并导致部分感染鸭死亡的蚊虫传播的黄病毒。2011年,对我国安徽地区鸭坦布苏病毒进行流行病学调查,从感染鸭群中分离出一株鸭坦布苏病毒(DTMUV-AH2011)。通过序列测定和全基因分析显示,DTMUV-AH2011分离株全基因为11,064nt,含有一个10,278nt的开放式阅读框,在开放式阅读框的5’端有94nt的5’NTR,开放式阅读框的3’端有692nt的3’NTR。与其他5株坦布苏病毒全基因相比,DTMUV-AH2011分离株的3’NTR有74nt的插入序列。通过对病毒编码蛋白氨基酸序列比对发现,近年来国内分离的所有坦布苏病毒均含有相对保守的多聚蛋白前体,氨基酸同源性在98.9%以上。除了NS4B蛋白没有氨基酸置换外,其余蛋白均有氨基酸的随机置换。对鸭坦布苏病毒的生物学特征和3’NTR插入基因的潜在功能分析,有利于进一步的了解病毒的复制和致病机制。