真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是全球污染最为严重的两类真菌毒素,尤其是北欧和北亚;在我国部分地区,其污染程度高达到100%。它们在基质中共存的特性引发的一系列联合效应,成为了近年来真菌毒素毒性研究的重点。大多数混合毒素联合效应都表现为多重效应现象,即在不同的浓度剂量、不同的毒素组合、不同的细胞模型以及不同的毒性作用时间可表现不同的联合效应结果:拮抗、加和、协同。本研究拟从代谢组的角度,剖析真菌毒素DON和ZEN在小鼠和细胞内的代谢组层次联合毒性效应,结合代谢组学、生物信息学,为真菌毒素DON和ZEN的联合毒性效应机制研究提供新的思路。其主要结论如下:1.真菌毒素DON和ZEN对小鼠血清和肝脏代谢组的影响表现为拮抗效应。在血清生化指标检测中,肝脏及肾脏病变指标在单一毒素组显著上调,在联合毒素组表现正常或无显著性变化,如碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、白蛋白等。肝脏病理切片结果,单一毒素可以诱发肝脏出现炎症细胞浸润症状和上皮细胞坏死症状,联合毒素组肝脏组织只出现轻微的炎症细胞浸润症状。热图分析和代谢通路分析表明,单一毒素组肝脏和血清中显著性变化的代谢物以及富集的代谢通路均多于联合毒素组。单一毒素DON组可以引起肝脏中L-丝氨酸、L-亮氨酸、丙酮酸、L-脯氨酸、马尿酸、苯丙氨酸等代谢物浓度显著性下调,以及O-糖基类代谢物显著性下调,包括乳果糖、D-海藻糖、塔罗糖、槐糖;在联合毒素组无显著性。血清代谢物分析结果显示,肌酸酐、苯丙氨酸、L-正亮氨酸、L-焦谷氨酸、L-甲硫氨酸、香叶醇等代谢物,只在单一毒素组中具有显著性。少部分代谢物在联合毒素组具有显著性,比如烟酰胺、3-吲哚乳酸、2-羟基吡啶。2.DON在实验剂量下未发现肾脏和脾脏的脏器比以及肾脏病变的生化指标,尿素氮和肌苷酸的显著性变化,但是通过代谢组分析发现,真菌毒素DON对小鼠肝脏和脾脏的代谢功能的影响。通过对肾脏和脾脏代谢物的多元变量统计分析,发现毒素DON组和对照组存在显著的主成分差异;结合代谢通路富集分析显示,肾脏中缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,受到影响;脾脏中缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径以及亚油酸代谢,是最为异常的代谢通路。整合代谢通路分析表明,肾脏中L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、马尿酸、丙酮酸等氨基酸和有机酸显著性下调;葡萄糖酸、半乳糖醛酸、核糖醇、甘油1-磷酸酯也显著下调。脾脏组织中检测到的总代谢物少于肾脏组,大多数氨基酸和有机酸均显示下降趋势,如L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、马尿酸、苯丙氨酸、花生酸、辛酸、亚油酸和十七烷酸等;部分脾脏代谢物显示上调趋势,包括氨基酸,如正缬氨酸、环亮氨酸等;有机酸,如丙酮酸、草酸等;许多酚类和醇类物质,如3-甲基丙醇、百里酚、膦酰霉素、1-茚醇。3.从小鼠尿液代谢物反映真菌毒素持续作用小鼠代谢组随时间的变化趋势。通过对DON持续作用小鼠尿液代谢物的检测,PCA结果显示,小鼠尿液中代谢物的主成分呈现明显的时间效应现象,随着时间的增加,代谢物主成分呈线性平移分布。小鼠尿液代谢物通路富集分析表示,尿液中受影响得分最高的三个代谢通路为,泛醌等萜醌类生物合成、苯丙氨酸代谢、柠檬酸循环。代谢物与疾病分析结果显示,DON持续诱导或促使小鼠发生酪氨酸血症,该疾病代谢标志物,对羟基苯基乙酸、4-羟苯丙酮酸、焦谷氨酸在DON诱导小鼠尿液代谢组中异常;此外,焦谷氨酸酶缺乏症以及原发性胆汁性肝硬化代谢标志物,焦谷氨酸和苯丙酮酸均在DON组小鼠尿液代谢物中表现异常。小鼠尿液整合代谢通路分析结果表示,DON作用的前48小时,受干预代谢通路主要是,苯丙氨酸代谢、柠檬酸循环、丙酮酸的代谢;随着作用时间持续到7天,糖类代谢通路,如糖酵解或糖异生、氨基糖和核苷酸糖的代谢开始出现异常,表现为蔗糖、海藻糖、塔洛、塔格糖等代谢物的显著性下调。4.小鼠尿液代谢物研究发现真菌毒素DON和ZEN对小鼠代谢组的毒性表现为拮抗效应。通过对第21天小鼠尿液代谢物的检测,结合多元变量统计分析,可以发现单一毒素组尿液主成分与对照组,可以通过主成分分析以及聚类分析分离,而联合毒素组不能与对照组分离。通过对三个剂量组中受到影响的代谢物做通路富集,发现受到干预的代谢通路有,半乳糖代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、TCA循环、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成、泛醌和其他萜类化合物-醌生物合成、甘油脂代谢、亚油酸代谢和甲烷代谢等。整合代谢通路分析结果表示,单一毒素组上调的尿液代谢物远超过联合毒素组;单一毒素组中,半乳糖及其下游代谢物,包括甘露醇、半乳糖酸、肌醇、塔格糖,相比于联合毒素DON+ZEN而言,表现为更显著的下降趋势;异亮氨酸、丙氨酸以及其相关酰基类氨基酸,包括N-乙酰基-L-谷氨酸、L-乙酰基-天冬氨酸等,仅在单一毒素组表现异常。真菌毒素DON和ZEN在本实验剂量设置下,尿液代谢物分析结果表现为拮抗作用。5.通过细胞存活率筛选对真菌毒素敏感的细胞模型巨噬细胞ANA-1,结合细胞凋亡实验优化体外代谢实验真菌毒素剂量浓度。通过OPLS-DA和S-plot筛选巨噬细胞胞内胞外单一毒素和联合毒素组的显著性代谢差异物,结合韦恩图分析、热图分析和代谢通路富集分析,发现甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢以及苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸代谢是最主要的两条受到干扰的代谢通路。单一毒素DON诱导胞外代谢物天冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、氧脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸等氨基酸的显著性上调,丙酮酸和1,5-脱水葡萄糖醇浓度下调;胞内代谢物中,糖类代谢物显著性下调,包括葡萄糖酸、葡萄糖、肌醇、核糖等。在单一毒素ZEN组中表现为雌激素效应标志物雌二醇上调;联合毒素DON+ZEN抑制ZEN的雌激素效应,加深了对戊糖磷酸途径、棕榈酸代谢的干扰,表现为核糖5-磷酸、2-脱氧-D-半乳糖以及棕榈酸、1-单棕榈酸显著性变化。