研究背景:围绝经期功能失调性子宫出血(简称“围绝经期功血”)是妇科常见病,是由于生殖内分泌轴功能紊乱造成的异常子宫出血。20%的围绝经期妇女可出现无排卵型功血。过去临床对围绝经期功血的药物治疗方法采用孕激素内膜脱落法、合成孕激素内膜萎缩法和应用抗纤溶止血药等,但均存在用药时间长,服药量大,副反应多等问题。米非司酮(Mifeprielone)是一种抗孕酮的药物,可与孕酮受体结合,竞争性的抑制孕激素发挥作用,另外,米非司酮还可抑制排卵、溶解黄体并影响子宫内膜的发育和功能,可增加子宫肌细胞对前列腺素的敏感性,在临床上广泛应用于终止早孕、辅助引产等方面。近年来,国内外有每日服用米非司酮连续3~6个月治疗围绝经期功血的报道,但长期服药依从性差、造成闭经等问题常使患者无法接受。因此寻找一种服药简便、患者易掌握、依从性好,副作用小的治疗方法,一直是妇科临床内分泌治疗研究的重点。在前期工作中,我们采用米非司酮五日三周期疗法治疗围绝经期功血,即诊刮后第3日开始服用米非司酮10mg/d,服药5d,并在以后的月经来潮首日再同法口服米非司酮5日,连续三个周期,共服药20片。结果表明疗效显著优于连续服药90日,并能帮助患者建立较为稳定的月经周期和经期。但仍有诸多问题尚待进一步研究,如对短周期、小剂量米非司酮可以建立正常月经周期的机理尚不清楚,多大剂量的米非司酮,作用多长时间可以通过影响子宫内膜血管生成,促子宫内膜细胞凋亡,使子宫内膜同步萎缩、脱落,从而达到治疗目的。以上问题的产生主要由于对米非司酮治疗围绝经期功血的机制尚不完全清楚,因此,观察米非司酮对人子宫内膜的作用,深入探索米非司酮治疗围绝经期功血的机制尤为重要,这也是本项研究的主要内容。随着对米非司酮药理作用的不断了解,目前认为其治疗围绝经期功血的机制主要可能包括以下几个方面:(1)米非司酮的抗孕酮作用降低了子宫内膜基质细胞中DNA合成的水平,从而降低子宫内膜局部合成雌激素水平。此外,米非司酮还通过非竞争性抗雌激素作用抑制雌激素受体介导的基因转录,从而抑制雌激素依赖性子宫内膜的增生,有丝分裂和分泌活性,可降低子宫内膜的厚度和湿重。(2)在雌激素存在情况下,米非司酮可以以剂量依赖的方式作用于垂体,抑制GnRH诱导的LH和FSH的分泌。此外,米非司酮也可以促进卵巢抑制素的分泌,从而抑制FSH分泌,影响卵泡的发育,并减少雌激素受体ESR和孕酮受体PGR在子宫内膜中的表达,这些作用可以影响子宫内膜的生长。(3)对雌激素和孕酮受体的影响和诱导凋亡。研究表明,米非司酮能在不依赖雌激素和孕激素的水平下,直接影响子宫内膜,降低雌激素和孕激素受体的含量,阻断子宫内膜对雌激素和孕激素性反应,从而抑制子宫内膜生长,促进子宫内膜细胞的凋亡。(4)直接影响子宫内膜血管的生成,米非司酮能使子宫内膜螺旋动脉萎缩变薄。这些均为米非司酮治疗围绝经期功血提供了理论依据和研究思路。本研究参考既往文献研究结果,提出假说:米非司酮通过影响雌、孕激素受体,阻断子宫内膜细胞对雌、孕激素的反应性,促进子宫内膜细胞凋亡,并抑制子宫内膜的血管内皮细胞分泌相关促血管生成因子,如血管生成素1(Ang-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),达到子宫内膜逐渐萎缩变薄,从而治疗围绝经期功血的目的。其中,Ang-1是目前作用于血管内皮细胞的因子之一,有促进内皮细胞增殖和新生血管形成的作用,而bFGF是一种具有广泛生物活性的肽类物质,通过自分泌或旁分泌形式促进细胞分裂增殖并强烈刺激血管新生,并有调节激素分泌等功能。有关bFGF在围绝经期功血中的变化及其机制的研究目前国内外尚鲜见,其在米非司酮作用下的人子宫内膜内皮细胞中如何变化,亦未见相关报道。此外,本研究还将从体外细胞学实验中观察米非司酮不同剂量、时间作用下的子宫内膜细胞和血管内皮细胞的变化情况,为米非司酮治疗围绝经期功血的提供进一步的理论依据。综上所述,系统性观察米非司酮在不同剂量、作用时间下对子宫内膜细胞的影响的体外研究目前国内外鲜有报道,本研究将通过观察不同剂量和作用时间暴露下的米非司酮对人子宫内膜细胞促凋亡因子和血管内皮细胞促血管生成因子表达的影响,并探讨其可能机制,为寻找围绝经期功血更加安全有效、简便经济的治疗方法提供理论依据。研究目的:本研究旨在探讨米非司酮对人子宫内膜细胞的作用,并初步探讨其作用机制,以期为临床使用米非司酮治疗围绝经期功血等子宫内膜疾病提供理论依据。研究对象和方法:1、不同浓度的米非司酮作用于人子宫内膜细胞,MTT法检测不同浓度的米非司酮在处理不同时间后对人子宫内膜细胞增殖活性的影响。2、不同浓度的米非司酮作用于人子宫内膜细胞后,显微镜下观察米非司酮对人子宫内膜细胞形态的影响。3、不同浓度的米非司酮处理人子宫内膜细胞,经Annexin V~+/PI~-双染后,通过流式细胞术检测不同浓度的米非司酮对人子宫内膜细胞凋亡水平的影响。4、不同浓度的米非司酮处理人子宫内膜细胞,免疫印迹(western blot)的方法检测米非司酮对人子宫内膜细胞中凋亡途径蛋白Bax、pro-caspase3/caspase3蛋白表达水平的影响。5、不同浓度的米非司酮处理人子宫内膜细胞,免疫印迹(western blot)的方法检测米非司酮对人子宫内膜细胞中坏死途径蛋白p-MLKL表达的影响,实时荧光定量PCR(real time PCR)的方法检测米非司酮对人子宫内膜细胞中坏死性凋亡途径因子RIPK3的表达影响。6、不同浓度的米非司酮处理人子宫内膜细胞,实时荧光定量PCR(real time PCR)的方法检测米非司酮对人子宫内膜细胞中雌激素受体ESR1和孕酮受体PGR的mRNA表达水平的影响。7、不同浓度的米非司酮处理人子宫内膜细胞,实时荧光定量PCR(real time PCR)的方法检测米非司酮对人子宫内膜细胞中促血管生成因子血管生成素1(Ang-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达水平的影响。研究结果:1、不同浓度的米非司酮分别处理人子宫内膜细胞24h、48h和72h后,MTT结果显示,米非司酮处理可抑制人子宫内膜细胞的活性,且米非司酮对人子宫内膜细胞的毒性作用随着浓度的增高、作用时间的延长而增强,米非司酮处理人子宫内膜细胞24h、48h和72h后的IC50分别为18μg/ml,15μg/ml,12μg/ml。2、不同浓度的米非司酮处理人子宫内膜细胞后,光学显微镜下观察细胞的形态,发现米非司酮处理过的细胞结构明显受损,表现为细胞膜边界不清晰、核染色质致密、细胞体积变小变圆、部分细胞出现破裂等,提示米非司酮对人子宫内膜细胞具有一定的损害作用,且子宫内膜细胞的数量明显较未处理时减少。3、不同浓度的米非司酮处理人子宫内膜细胞后,流式细胞术检测结果显示,米非司酮可促进人子宫内膜细胞的凋亡,且米非司酮对人子宫内膜细胞的凋亡促进作用随着浓度的增高而增大。4、免疫印迹(western blot)结果显示,米非司酮处理的人子宫内膜细胞中促凋亡相关蛋白Bax、pro-caspase-3、caspase-3的表达水平明显上升。5、免疫印迹(western blot)结果显示,不同浓度的米非司酮处理后的人子宫内膜细胞中坏死途径蛋白p-MLKL的表达明显增加,实时荧光定量PCR(real timePCR)的检测结果显示,米非司酮处理的人子宫内膜细胞中坏死性凋亡途径因子RIPK3的表达亦明显上调。6、实时荧光定量PCR(real time PCR)的检测结果显示,5、15、20ug/ml的米非司酮处理人子宫内膜细胞后,细胞内的雌激素受体ESR1的含量明显下降,而5、10、15、20ug/ml的的米非司酮处理人子宫内膜细胞后细胞内的孕酮受体PGR的含量均明显下降。7、实时荧光定量PCR(real time PCR)的检测结果显示,不同浓度的米非司酮处理人子宫内膜细胞后,细胞内Ang-1和bFGF的表达水平显著降低。结论:1、米非司酮可影响人子宫内膜细胞的细胞形态并抑制人子宫内膜细胞的生长,且具有剂量和时间依赖性。2、米非司酮可通过上调促凋亡相关蛋白Bax、pro-caspase-3、caspase-3的表达促进人子宫内膜细胞的凋亡从而发挥抑制细胞增殖的作用。3、米非司酮可通过上调坏死途径蛋白p-MLKL、坏死性凋亡因子RIPK3的表达促进人子宫内膜细胞的坏死而发挥抑制细胞增殖的作用。4、米非司酮可能通过下调雌激素受体ESR1和孕酮受体PGR的表达在人子宫内膜的生长发育中发挥重要作用。5、米非司酮可以通过下调Ang-1和bFGF的表达,抑制人子宫内膜血管生成,可能在抑制子宫出血中发挥作用。本研究观察了米非司酮在不同浓度、不同时间作用的情况下对人子宫内膜细胞生长的影响,发现米非司酮可通过促进细胞凋亡相关蛋白Bax、pro-caspase-3、caspase-3的表达而促进人子宫内膜细胞的凋亡,并通过上调坏死途径蛋白p-MLKL、坏死性凋亡因子RIPK3的表达促进人子宫内膜细胞的坏死进而抑制细胞生长。米非司酮还可通过下调雌激素受体ESR1和孕酮受体PGR的表达在人子宫内膜的生长发育中发挥重要作用,通过下调Ang-1与bFGF的表达,抑制人子宫内膜血管生成。本研究为制定米非司酮在治疗围绝经期功血中的临床治疗策略提供了一定的实验数据和理论支持。