多卤代芳基酮经不对称还原后所得的手性醇类化合物是一系列抗真菌、抗抑郁及止吐药物的重要中间体。鉴于多卤取代芳基酮大多为疏水性的非天然底物,现有多卤代还原酶对该类底物催化活力普遍偏低,且同时存在底物抑制、产物失活和耐受性差等诸多问题,故获得高效、稳定的多卤代芳基酮还原酶是目前亟待解决的关键科学问题。本文以高效多卤代芳基酮还原酶的开发与利用为出发点,分别从生物催化剂的挖掘与筛选、蛋白质晶体结构解析与分子改造和多卤代芳基醇的制备等方面开展了较为系统的研究。本课题以多卤代芳基酮2,2’,4’-三氯苯乙酮(TCAP)为底物,通过基因组数据库挖掘和酶库筛选,成功获得来源于Scheffersomyces stipitis CBS 6045的卤代芳基酮还原酶SsCR。实验表明,该酶底物谱较广,对卤代芳基酮、脂肪酮、芳香酮酯及脂肪酮酯等多种底物具有催化活力;对多种卤代酮底物具有较高活性,其中对底物TCAP的活力高达65 U mg-1,产物ee值高达99.9%。SsCR的最适反应pH为6.5,最适温度为30℃。动力学表征实验显示SsCR对TCAP和2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙酮的催化效率常数(kcat/Km)分别高达4.51×103 s-1 mM-1和2.65×104 s-1mM-1。通过优化SsCR对TCAP的不对称还原反应条件,最终底物上载量为300 mM,时空产率(STY)高达268 g L-1 d-1,产物分离得率为88.2%,环境因子E-factor为7.25。同时通过动力学表征发现,该酶的底物抑制常数Ki仅为1mM,而在添加二甲基亚砜的实际反应体系中底物溶解度约为2 mM,因此在该反应体系中该酶的活性受到了很大程度的抑制。为探索与解决这一问题,实验进一步解析获得了还原酶SsCR的晶体结构(PDB ID:5GMO)和SsCR-NADP+复合物的晶体结构(PDB ID:5YW4)。综合比较上述晶体结构后发现,蛋白分子中的两段loop结构(loop-80和loop-200)在辅酶结合前后发生了显著的构象变化,推测这对辅酶的结合、活性口袋的形成及催化反应的进行起到了至关重要的作用。鉴于两段loop的最近端是由氨基酸Va184、Phe86和Leu211组成的疏水簇,我们利用中性及亲水性氨基酸对上述氨基酸进行了替换突变,最终筛选获得一株有益突变体L211H。其底物抑制常数Ki较母本提高了 16倍,有效减弱了底物抑制作用;且同时保留了其原有的催化性能。通过对突变体L211H进行晶体解析和分子动力学模拟发现,loop-80和loop-200的构象灵活性相较母本有所增加,占据了母本中抑制型底物结合部位,减少了非催化性四元复合物E-NADPH/NADP+-S-Si的形成。在底物上载量为100 mM,纯酶添加量为10 mg L-1的条件下,突变体L211H还原反应过程中的时空产率是母本的3.0倍。生物催化剂的稳定性是限制其工业化应用的重要因素之一。本课题中筛选获得的还原酶SsCR在40℃下的半衰期仅为5 min,在添加5 mM产物条件下半衰期仅为44 min。利用易错PCR的方法构建随机突变库,同时进行热稳定性和产物耐受性的筛选,所得突变体SsCRM4的T5015值为41.5℃,相较于母本提高了 5.4℃;40℃半衰期延长至14h,是母本的170倍;产物耐受性的半衰期Pt1/2为38 h,是母本的52倍。利用该突变体作为催化剂,整细胞催化剂的上载量为1.25 g L-1,TCAP上载量进一步提高到了 600mM,比转化率S/C为107(g/g),反应器时空产率达到664 g L-1 d-1。总之,本研究开发了一种可高效催化还原多卤代芳基酮的还原酶SsCR,基于蛋白结构解析和计算机模拟指导的分子改造(Loop Engineering)有效缓解了该酶的底物抑制作用,进而结合定向进化的方法提高了SsCR的热稳定性和产物耐受性,有效改善了该还原酶对非天然底物的催化性能,最终建立生物催化还原合成多卤代芳基手性醇的高效绿色反应体系。