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研究目的: 本研究旨在筛选新生儿ARDS血清中差异表达的miRNAs,并评估利用筛选出的血清miRNAs作为新生儿ARDS早期诊断标志物的可行性。 研究方法: 本研究共分两个部分。 第一部分:收集新生儿ARDS患儿血清各50例,健康新生儿血清32例,随机选取9例病例组(ARDS组)及3例健康对照组(NC组)的血清,提取血清总RNA(含有miRNAs),利用miRNA芯片筛选出ARDS相对于正常组的差异性miRNAs表达谱。根据预设的条件,从初步筛选出的miRNAs中进一步筛选以进行第二部分的研究。 第二部分:随机选取18例ARDS及17例NC组新生儿的血清标本,采用TaqManqRT-PCR的方法对第一部分中筛选出的2种候选miRNAs进行定量研究和验证,比较这两种miRNAs的表达水平在各组间的差异是否与芯片结果一致,并对其检验效能进行评价。 实验结果: 第一部分: 1、两组血清样本均可提取出合格的RNA 分别从ARDS组及NC组血清中提取总RNA,采用分光光度法检测OD260/280,比值均符合要求。 2、总RNA与miRNA芯片杂交 用ARDS组及NC组提取出的总RNA与miRNA芯片杂交,得到9张成像均匀、清晰的杂交图像,可证实总RNA中含有miRNAs。 3、miRNAs在ARDS组及NC组血清中表达存在差异 采用GenePixproV6.0软件,对探针点的初始荧光强度进行分析,然后对初始强度值进行标准化及归一化处理,筛选出两组间差异表达的miRNAs。以表达水平变化倍数R≥2为界,共有318种差异表达的miRNA,其中132种在ARDS病例组相对于健康对照组上调,186种下调。 4、筛选出两种候选miRNAs 以表达水平变化倍数R≥15为界,将上调和下调倍数在前5位的miRNAs选出,计算标准值ARDS-NC,最后筛选出两种miRNA作为候选的血清学标志物。 第二部分: 1、各血清标本中均可提取出合格的RNA 两组血清标本提取的总RNA,OD260/280的比值均符合要求。 2、外参基因表达稳定 参考文献,初步选定线虫miR-39作为外参基因。通过检测其在各标本间的表达水平,结果显示,两组间外参的Ct值未见显著性差异。 3、候选miRNAs的初步验证与筛选 外参线虫miR-39及目标miRNA均能有效扩增。以参线虫miR-39为外参,对各miRNAs的表达水平进行标准化分析,通过统计学分析发现,第一部分实验中筛选出的miR-3120及miR-20a在ARDS组及NC组之间的表达存在显著性差异,芯片与PCR结果一致。 4、miR-3120及miR-20a的检验效能 以此次入组的血清样本为基础(N=35),利用ROC曲线分析miR-20a及miR-3120对ARDS和健康对照组的鉴别效能。结果显示,miR-20a通过ROC分析得到的最佳cut-off值为82.1,敏感性和特异性分别为94.1％和94.4%,得到的曲线下面积(AUC)为0.99;miR-3120的最佳cut-off值为27.3,敏感性和特异性分别为50.0%和70.6%,得到的曲线下面积(AUC)为0.52。 结论: 1、新生儿ARDS患者及健康对照血清中均有miRNAs的表达; 2、芯片检测发现,某些miRNAs的血清表达水平在ARDS组及健康对照组之间存在显著性差异,本实验筛选出318种差异表达的miRNA,其中132种在ARDS病例组相对于NC组上调,186种下调; 3、进一步筛选出两种miRNAs采用TaqManRT-PCR进行验证,与芯片结果一致; 4、利用ROC曲线分析显示,miR-20a在区分ARDS组及NC组有一定的敏感性及特异性,可作为潜在的ARDS血清学标志物。