犬腺病毒（Canine adenovirus，CAV）属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属，是哺乳动物腺病毒中致病性最强的一种，分为1型和2型。犬1型腺病毒（CAV-1）可以引起犬传染性肝炎和狐狸 熊的脑炎以及单纯的呼吸道疾病；犬2型腺病毒（CAV-2）引起犬的传染性喉气管炎和肠炎。CAV-1弱毒疫苗虽然已最大限度致弱，但还会引起眼、肾病变，造成免疫犬发生前眼色素层炎，形成短暂角膜浑浊的“蓝眼”。由于CAV-2和CAV-1具有交叉免疫作用，而且CAV-2弱毒苗克服了CAV-1弱毒苗的现有缺点，能激发体液免疫和细胞免疫，可同时保护动物抵抗CAV-1和CAV-2的感染。因此目前世界上用于犬腺病毒感染的疫苗都采用CAV-2弱毒疫苗。 以病毒为载体的重组疫苗能很好地表达外源基因，其表达产物能诱导机体产生高水平的细胞免疫和体液免疫反应，并产生免疫保护。腺病毒因其具有宿主范围广泛、感染滴度高、安全、稳定以及应用方便等优点而成为研究重组疫苗和人类基因治疗的热点。以人、猪、牛、羊、禽等腺病毒为载体的重组疫苗相继获得成功，如用人5型腺病毒构建的狂犬病病毒糖蛋白基因重组疫苗用于野生动物狂犬病的免疫，获得了良好的预防效果。但人腺病毒不能在动物体内很好的繁殖，这就影响了重组疫苗的免疫效果，犬科动物对CAV易感且本身就具免疫原性，插入外源性抗原基因即为二联基因工程苗，可同时对犬和野生动物进行两种疾病的免疫预防。采用犬2型腺病毒为载体进行重组疫苗的研究很早就引起了国内外学者的兴趣，但由于其同源重组效率低、表达调控机制不明等原因，迄今尚无相关报道。 本实验以分离驯化的CAV-2弱毒疫苗SY株为基础，提取全基因组DNA后直接进行酶切，分别回收含E1区的EcoRⅠC片段和含E3区的KpnⅠB片段，将它们克隆到质粒pGEM-3zf和pBluescriptⅡKS（+）中，得到重组质粒pG-E1和pBE3-2，并对克隆的CAV-2 SY株E1、E3区进行了序列测定和分析，结果表明CAV-2 SY株E1区序列与CAV-2Toronto A26/61株的完全相同，而与Vaxitas株的序列的最大同源性为99.8％。CAV-2 SY株E3区序列与CAV-2 Toronto A26/61株以及Manhattan株的E3区序列则完全相同。在克隆的CAV-2 SY株E3区重组质粒pBE3-2的基础上，通过酶切消除多克隆位点，经连续两次点突变，在E3区的首尾两端各引入一个Bg1Ⅱ酶切位点，用Bg1Ⅱ酶切后自连得到E3区缺失的质粒pBΔE3，并在该位点加入人工接头，得到质粒pBE3L。然后通过一系列重组，构建了含有和不含外源性启动子的荧光蛋白（GFP）基因和狂犬病病毒糖蛋白（Rgp）基因的表达质粒，分别命名为pBE3LCGFP、pBE3LGFP、pBE3Rgp和pBE3LCRgp，其中不含外源性启动子的表达质粒其外源基因的阅读框架与E3区的阅读框架保持一致。以4个重组质粒各5μg转染DK细胞。对含有和不含外源性启动子的绿色荧光蛋白基因重组质粒pBE3LCGFP和pBE3LGFP，分别于转染后24h、48h、72h和96h直接在荧光显 中文摘要一微镜下观察荧光；狂犬病病毒糖蛋白基因重组质粒 pBE3Rgp和 pBE3LCRgp，分别于转染后24h、48h、72h和96h时，以抗狂犬病病毒糖蛋白的单克隆抗体和羊抗鼠荧光抗体对细胞单层进行兔疫荧光染色检测。结果表明，含有启动于的重组质粒pBE3LCGFP在转染24h后即可观察到荧光，4M6h以上荧光无明显差别，转染细胞经两次传代后仍可见荧光细胞，但数量明显减少。不含外源性启动子的重组质粒pBE3LcFP在转染后始终未观察到荧光。对 Rgp基因重组质粒转染细胞单层的免疫荧光染色结果与荧光蛋白基因的转染结果一致，即含有外源性启动于的N刃基因能表达，不含外源性启动于的则不能表达。说明在构建的E3区缺失质粒中，E3区本身的启动子不能启动外源基因的表达，必需携带外源启动子。由于所构建的表达质粒在 E3区外两端各包括有 Ikb以上的 CAV－2核酸序列，并同时具有两个单一酶切位点，因此可用于体外的人工重组和细胞内的同源重组。 为了进行重组病毒的研究，首次建立了稳定的 CAV－2 EI转化细胞系，将带有 CAV－ZSY株EI区的质粒灿－EI用B刀RI和B团血H1将m区片段转移到pC DNDNA3上，构建了重组质粒pC－EI。再用 BStX对pG－EI进行酶切，以缺失EI区起始密码子前的多余片段，再用 ECOR和 BamH将m片段克隆到 pGDNA3上，构建m表达质粒 pG－Elt，然后用这两种质粒对 DK细胞分别进行转染，在保持 ling／ffil的 G418浓度筛选压力下，三周后分别得到刀和26个克隆细胞。m转化细胞株的KR鉴定结果表明，pC－m质粒转染得到的 23个细胞克隆和 po－Elt质粒转染得到的 26个细胞克隆中均能扩增出 EIA 652hP的特异片段，说明转化细胞中整合有E！片段。RT－PCR结果显示pC－EI质粒转染得到的刀个细胞克隆无特异性扩增带，说明EIA不转录：而W－Elt质粒转染得到的拈个细胞克隆中部分能扩增出EIA 536hp的特异性片段，其中6株细胞为RT－PCR强阳性，说明EIA获得表达。其余为 RT．PCR弱阳性或阴性。用抗 CAV－2 SY株犬血清及碱性磷酸酶标