论文部分内容阅读
目的:
1.在聚丙烯酰胺凝胶上建立一种检测DNA的方法;
2.在聚丙烯酰胺凝胶上建立一种特异性检测糖基化蛋白质的方法。
方法:
1.DNA染料染色检测法:选用碱性品红作为染料，首先初步建立一种检测方法，之后考察各个对染色结果产生影响的因素，如染色液组成、染色时间以及脱色时间等，确定各个条件，逐步完善初步建立的检测方法，最终建立完整的DNA染料染色检测方法。
2.糖基化蛋白质荧光检测法:选用丹酰肼作为染料，首先初步建立一种检测方法，之后考察各个对染色结果产生影响的因素，如固定液组成、染色液组成、脱色液组成以及各个步骤的时间等，确定各个条件，逐步完善初步建立的检测方法，最终建立完整的糖基化蛋白质检测方法。
结果:
1.建立了一种完整的DNA染料染色检测方法，可在凝胶上检测出10-20 pg/band的DNA，其灵敏度比商业化荧光染色试剂盒SYBR Gold高4倍，与GEHealthcare公司的DNA银染试剂盒灵敏度相近，且机理实验表明碱性品红和DNA的结合方式为非嵌入式结合，与经典EB荧光检测法的嵌入式不同，无致畸毒性。本方法操纵步骤如下:
(1)固定:将电泳后的凝胶置于50 ml固定液中固定30 min，固定液组成:40％乙醇/10％乙酸;
(2)染色:将凝胶置于50 ml染色液中染色5 min，染色液的组成:0.04％碱性品红水溶液;
(3)水洗:将凝胶置于50 ml去离子水中洗涤2次，每次10s;
(4)显影:将凝胶置于50 ml0.1％铁氰化钾(35-50℃)显影2min;
(5)终止:将凝胶置于去离子水中(35-50℃)终止显影。
2.建立了一种完整的糖基化蛋白质荧光染色检测法，可在凝胶上检测出2-8ng/band的糖基化蛋白质，其灵敏度与商业化糖基化蛋白质染色试剂盒Pro-Q Emerald相近。本方法操作步骤如下:
(1)固定氧化:将电泳后的凝胶放入固定氧化液固定氧化10m in，固定氧化液组成:40％乙醇/10％乙酸/0.5％高碘酸;
(2)酸洗:将凝胶置于3％乙酸洗涤3次，每次5 min;
(3)染色:将凝胶置于染色液中染色40 min，染色液组成:0.6％丹酰肼/0.5％氯化镁/3％乙酸;
(4)脱色:将凝胶置于脱色液一和二中各脱色10 min，脱色液一组成:0.1％乙酸锌/3％乙酸，脱色液二组成:3％乙酸。
结论:
1.本实验在聚丙烯酰胺凝胶上建立了一种DNA染料染色检测法，该方法灵敏度高，且机理实验结果表明碱性品红与DNA的结合方式为非嵌入式结合，安全无致畸性，有望代替经典EB荧光染色法;
2.本实验在聚丙烯酰胺凝胶上建立了一种糖基化蛋白质荧光检测法，该方法具有灵敏度高、特异性强、操作便捷等优点，适合糖基化蛋白质组学研究。