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丙型肝炎病毒(HCV)是1989年发现的导致非甲非乙型肝炎的主要病原体，其严重危害人类健康。据2017年WHO全球肝炎报告，目前全球HCV感染者已达7.1亿人，每年感染人数还在不断递增。目前HCV治疗的药物主要是2013年12月经美国食品药品监督管理局(FDA)批准在美国上市的索菲布韦(Sofosbuvir)，是首个无需联合干扰素就能安全有效的治疗某些类型丙肝的药物，但其价格极其昂贵，需花费8.4万美金/疗程，普通患者难以支付天价药费。中国有2016年上市的长效干扰素派格宾，但目前还没有针对HCV的疫苗，其主要原因是缺乏合适的细胞模型和动物模型用于HCV疫苗及药物有效性和安全性评价。 目前对HCV研究主要的细胞模型有淋巴细胞模型、原代肝细胞模型、肝癌细胞系模型和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)起源的肝样细胞模型;动物模型主要有黑猩猩模型、小鼠模型和大鼠模型。但这些细胞模型对抗HCV药物筛选稳定性和持续性不高，黑猩猩动物模型受动物福利伦理的限制，已不允许使用，大、小鼠模型与人因种属原因存在较大差异。因此，如何建立高效稳定特异性强的细胞模型和动物模型是HCV药物与疫苗评价急需解决的科学与技术的关键问题。 树鼩是比啮齿类动物更接近非人灵长类的动物，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSCs)特性稳定，体外易于获得及扩增，能连续传代和进行各种基因的遗传操作，既能保持本身基因的稳定性，还能高效表达外源基因。利用树鼩BM-MSCs开展HCV相关研究相对于啮齿类动物BM-MSCs有其不可替代的优势。 miR-122是一种肝脏特异性的miRNA，系第一个被证明与HCV病毒复制成正相关的宿主miRNA。本研究选择能长期传代培养的BM-MSCs，利用miR-122既能促进干细胞向肝细胞分化又能促进HCV增殖的双重特性，向树鼩BM-MSCs转染人miR-122，以期提高BM-MSCs对HCV的易感性。利用受体介导HCV入胞的功能，将HCV入胞的两个最为关键的人的CD81和Occludin受体转染至该细胞，以期建立对HCV易感的细胞模型，为HCV的药物筛选、疫苗研发、致病机理研究提供一种新的资源，也为将来创建慢性持续性感染的HCV树鼩模型奠定基础。具体研究内容及结果如下: 一、树鼩骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定 采用密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化，通过倒置相差显微镜进行形态学观察，向成脂成骨和向神经元样细胞诱导分化，所分离的细胞确定是BM-MSCs，为下一步应用树鼩BM-MSCs建立HCV细胞模型提供合格和足量的细胞资源。 二、CD81/OCLN/miR-122慢病毒载体构建及慢病毒转染树鼩BM-MSCs 构建了含人CD81/OCLN/miR-122慢病毒载体并将其转染至BM-MSCs，利用实时荧光定量PCR技术检测到CD81、OCLN和miR-122基因的表达，流式细胞术可以检测到CD81和OCLN分子的表达;同时Western-blot结果显示，CD81和OCLN可以在树鼩骨髓间充质干细胞中表达。在树鼩BM-MSCs上转染含人CD81/OCLN慢病毒载体后，能向成脂成骨诱导分化，但诱导的脂肪细胞和成骨细胞数量比未转染组少。 三、HCV感染树鼩骨髓间充质干细胞的研究 用基于HCV2a-JFH1-Huh7.5.1培养的HCVcc感染转染基因后的树鼩BM-MSCs，分析了HCVcc在树鼩BM-MSCs上的感染复制能力和是否产生感染性病毒颗粒，研究结果表明:HCVcc感染OCLN/BM-MSCs，CD81/BM-MSCs，miR-122/BM-MSCs，CD81/miR-122/BM-MSCs,OCLN/miR-122/BM-MSCs,OCLN/CD81/BM-MSCs,OCLN/CD81/miR-122/BM-MSCs后，巢式PCR能检测到HCV复制增殖的中间体-负链RNA，说明该细胞可以支持HCVcc入胞并复制增殖。其中OCLN/CD81/BM-MSCs，OCLN/CD81/miR-122/BM-MSCs细胞上清能产生具有感染性的HCV病毒颗粒。并验证了HCV入胞、复制和产出具有感染性的病毒颗粒需要HCV受体CD81、OCLN的相互作用，miR-122的存在可以提高对HCV的易感性。VEGF的加入可能通过破坏细胞极性从而显著提高靶细胞对HCVcc的易感性。 综上，本研究建立了HCV易感的树鼩骨髓间充质干细胞模型，HCV在该细胞上可以完成HCV的生活史，并产生具有感染性的病毒颗粒，这在利用骨髓间充质干细胞建立HCV细胞模型尚属首次，为开展HCV生命周期研究、抗HCV药物筛选、疫苗研发和致病机理研究提供了新的技术平台。