近年来创伤、感染等各种原因是造成骨折、骨不愈合、骨折延迟愈合的重要原因,一直是威胁全人类生命健康的医学难题。为了从根本上提高其治疗效果,探讨骨形成、重建、塑形的生物学机制及其病理生理学特点是很有必要的。骨组织是一种复杂的动态组织,伴随着细胞外基质矿化,能根据需要不断自我修复,同时亦是带有神经支配、血管伴行的生物活性组织,因此,骨折修复的过程常常伴有机体细胞因子、多种组织之间错综复杂的协同作用,与血液供应、神经支配也密切相关,保证其修复区域内环境的生物学稳定,尤其是神经支配和血液供应的重建是关键因素。血液供应的重建在骨生理中的作用已被众多研究者探讨并证实了其重要性,除此之外,骨组织再生过程中神经因素可能同样发挥着极其重要的作用。早期研究者进行的骨发育学实验显示：先天颅面发育缺陷疾病同时也伴有神经系统发育障碍的现象提示神经系统可能对骨发育支配和调节起到重要作用。此外,众多研究已证实神经因素对骨修复、骨折愈合具有调节作用。但是目前关于神经因素在骨组织再生中的生物学机制研究较少。Wang等发现植入感觉神经能明显促进组织工程骨成骨并且能够修复骨缺损,同时骨再生区域的P物质(substance P, SP)、降钙素基因相关肽(calcitoningene-related peptide, CGRP)、神经肽Y (neuropeptide Y)含量明显增加,提示我们在骨折愈合、骨重建中神经肽类物质可能起到重要作用。近些年来,在骨折愈合、骨组织再生中神经肽类物质的重要作用逐渐被人们重视,并成为国内、外学者研究热点之一。神经肽是一种肽类物质,由神经系统产生具有神经调节活性,其中,SP、CGRP、NPY是最具代表性的物质。SP和CGRP是感觉神经纤维分泌的两种主要神经肽；NPY是中枢神经系统中分布最广、含量最高神经肽之一,介导外周神经系统与中枢神经系统调控的重要因子。SP作为一种可由骨骼感觉神经元分泌的重要神经递质,在骨生理调节中起到重要作用,神经肽SP属于速激肽,目前已经发现5种速激肽亚型,(SP、速激肽A、速激肽B、速激肽C、速激肽K)3种SP受体(NK1、2和3受体),神经肽SP在许多生理过程中的调节作用是通过NK1受体发挥作用的。目前的研究多集中在神经肽对成骨细胞的影响,对成骨细胞的前体细胞—骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells, BMSCs)、MC3T3E1细胞的研究较少。BMSCs具有很强的增殖能力和多向分化的潜能,在骨生理中扮演着重要角色,在适宜的体外或者体内环境中可被诱导分化为成骨细胞、基质细胞、软骨细胞和造血细胞等多种细胞,是骨组织工程研究中的理想种子细胞；MC3T3E1细胞是成骨前细胞,具有一定的成骨特性,在适宜的体内外环境中可以向成骨细胞分化,因而也经常用作种子,应用于骨组织工程。因此,阐明神经肽对BMSCs、 MC3T3E1细胞的具体作用有助于我们更全面地了解神经肽在骨生理过程中发挥的作用,进一步揭示神经生物学骨再生过程中的作用机制。从分子信号转导机制的角度而言,探究SP究竟是通过何种信号转导通路发挥其对BMSCs及MC3T3E1细胞的生物学调控效应同样重要。目前关于BMSCs及MC3T3E1成骨分化过程中SP的生物学作用及信号转导机制的研究较少。Wnt/β-catenin信号转导通路是目前骨骼系统相关疾病发病机制和骨代谢研究的热点。Wnts蛋白与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDLreceptor-relatedprotein, Lrp) Frizzleds受体(Fzd)受体复合体结合后,通过一系列胞质蛋白(Dsh、Gsk3β、 APC、Axin等)的相互作用,使得p-连环蛋白(β-catenin)在胞质稳定并累积,β-catenin入核后与转录因子：T细胞因子(T cell factor, Tcf)/淋巴增强因子-1(lymphoid enhancer factor1, Lef-1)作用,通过作用于靶基因而发挥调节作用。这条通路被称为Wnt/β-catenin经典途径。因此本研究以BMSCs、MC3T3E1细胞为研究对象,探讨SP对其增殖、分化的影响,并从Wnt/β-catenin信号转导通路角度探讨其相关机制。为进一步深入探讨骨再生、骨代谢过程中的神经生物学调节机制及Wnt/β-catenin信号转导通路调节机制奠定一定基础,同时也可为其在骨折以及骨代谢疾病中的临床应用提供新的思路和实验依据。研究目的1.神经肽SP对BMSCs增殖的影响及与Wnt/β-catenin信号转导通路的关系2.神经肽SP对BMSCs成骨分化的影响及与Wnt/β-catenin信号转导通路的关系3.神申经肽SP对MC3T3E1细胞成骨分化的影响及与Wnt/β-catenin信号转导通路的关系第1部分SP对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及Wnt/p-catenin信号转导通路的影响研究目的：获取用于实验的种子细胞BMSCs,并对其表面标志物进行检测,同时探讨SP对BMSCs增殖、Wnt/p-catenin信号转导通路的影响实验方法：1.取28～35d,130-150g SD大鼠脱颈处死,全骨髓法分离BMSCs,加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基,培养72h后,换液去除悬浮的血细胞等未贴壁细胞后分瓶培养,接种于25cm2塑料培养瓶中,采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养。培养基2-3d换液1次,7-9d细胞汇合后可传代,按1：2传代,光镜及倒置显微镜观察体外培养细胞的生长、增殖和细胞形态变化。胰酶消化P3代BMSCs,用PBS清洗3遍,计数细胞,重悬细胞后用流式鉴定法检测表面标记CD29、CD34、CD44、CD45表达情况。2.取第3代细胞,细胞被分为四组,SP (10-8mol/L)组,SP+SP受体拮抗剂组(1μmol/1), SP+DKK1组(0.2mg/mL),对照组(等量PBS)。细胞接种于96孔板,接种细胞密度为3000/cm2,每天换液,同时更换刺激物,刺激1、3、5、7、9d,每实验组均设3个复孔,刺激结束后,按照Alamar Blue说明书指导进行操作,每个时间点每个孔都进行荧光值的测定,测定波长为：激发波长(570nm)、发射波长(585nm)。3.取第3代细胞,细胞被分为四组,SP (10-8mol/L)组,SP+SP受体拮抗剂组(1μmol/1), SP+DKK1组(0.2mg/mL),对照组(等量PBS)。分别用Q-PCR以及Western blot法分别于第1、3、5、7d检测各组Wnt/β-catenin信号转导通路相关基因及蛋白的表达,同时用免疫荧光法于培养第4d检测β-catenin在各组细胞中的分布情况。实验结果：1.成功分离培养出的第3代细胞,经流式鉴定结果显示,细胞表面标记CD29(93.5%±2.3)和CD44(87.5%±3.9)阳性,CD34(5.5%±1.6)和CD45(11.2%±3.4)阴性,表明培养细胞为BMSCs。2.SP组荧光值在1,3,5,7,9d都明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05), SP+SP受体拮抗剂组、SP+DKK1组荧光值均低于SP组,差异有统计学差异(p<0.05)。3.Q-PCR结果显示SP作用于BMSCs能促进C-myc mRNA, Lefl的表达,降低Tcf7的表达,SP受体拮抗剂、DKK1能抑制SP的这些作用；而P-catenin mRNA, Cyclin D1mRNA的表达则不受影响。Western blot结果显示SP能提高C-myc蛋白、P-catenin蛋白的表达,降低p-β-catenin的表达,SP受体拮抗剂、DKK1能抑制SP的这些作用。免疫荧光结果显示SP能促进β-catenin在细胞内的核内分布,SP受体拮抗剂、DKK1能抑制SP的这种作用。结论：通过全骨髓法分离法可获得BMSCs, SP能促进BMSCs增殖,同时能提高与Wnt/β-catenin信号转导通路激活相关基因及蛋白的表达,能促进β-catenin的入核,最终激活Wnt/β-catenin信号转导通路,而SP受体拮抗剂、DKK1能抑制SP的这些作用。这些结果表明SP能促进BMSCs增殖,Wnt/β-catenin信号转导通路可能参与其调节。第2部分SP对BMSCs成骨分化、Wnt/β-catenin信号转导通路的影响研究目的：探讨SP对BMSCs成骨分化的影响,并从Wnt/p-catenin信号转导通路角度探讨其相关机制。实验方法：全骨髓法分离、培养BMSCs,取第3代细胞,首先细胞被分为三组,SP(10-8mol/L)组, SP (10-12mol/L)组,对照组,每组均在成骨诱导环境下(L-DMEM+10mMβ-磷酸甘油钠+100nm地塞米松+50μg/mL维生素C+10%FBS)进行培养,于培养第7,14d用Q-PCR法分别检测各组成骨标志物(alkaline phosphatase mRNA, collagen type I mRNA, osteocalcin mRNA, Runx2mRNA)的表达,以确定在成骨诱导环境下对BMSCs成骨分化有明显促进作用的SP浓度。根据第一步所确定的SP浓度,用于下面实验,细胞被分成四组,SP组,SP+SP受体拮抗剂组(1μmol/l), SP+DKK1组(0.2mg/mL),对照组(等量PBS),每组均在成骨诱导环境下进行培养,培养第7,14d用Q-PCR法分别检测各组成骨标志物、Wnt/β-catenin信号转导通路相关基因(C-myc mRNA, cyclin Dl mRNA, Lefl, Tcf7及β-catenin mRNA)的表达。实验结果：10-12mol/L SP能明显促进成骨标志物的表达,而高浓度SP (10-8mol/L)则无此作用,同时10-12mol/L SP能明显提高C-myc mRNA, cyclin D1mRNA, Lefl的表达,降低Tcf7的表达,而不影响β-catenin mRNA的表达,SP的这些作用能被SP受体拮抗剂、DKK1所阻滞。结论：低浓度SP (10-12mol/L)能在成骨诱导环境中能明显促进BMSCs向成骨分化,同时能激活Wnt/β-catenin信号转导通路,因此我们推测SP (10-12mol/L)能在成骨诱导环境中能明显促进BMSCs向成骨分化,Wnt/p-catenin信号转导通路可能参与其调控。第3部分SP对成骨前细胞(MC3T3E1细胞)成骨分化、Wnt/β-catenin信号转导通路的影响实验目的：研究SP对成骨前细胞(MC3T3E1细胞)成骨分化的影响,并从Wnt/β-catenin信号转导通路的角度探讨其相关机制实验方法：1.MC3T3E1细胞购自美国细胞库,培养条件为a-MEM+10%FBS,细胞传至第6代,光镜及倒置显微镜观察体外培养细胞的生长、细胞形态,同时分别用茜素红染色法、碱性磷酸酶染色法对MC3T3E1细胞进行染色。2.取第6代细胞,首先细胞被分为四组,SP(10-8mol/L)组,SP(10-9mol/L)组,SP(10-10mol/L)组,对照组,每组均在成骨诱导环境下(a-MEM+10%FBS+10mM β-磷酸甘油钠±50μg/mL维生素C)进行培养,于培养第4,7,14d用Q-PCR法分别检测各组成骨标志物(alkaline phosphatase mRNA, collagen type I mRNA, osteocalcin mRNA, Runx2mRNA)的表达,以确定在成骨诱导环境下对BMSCs成骨分化有明显促进作用的SP浓度。3.根据上一步所确定的SP浓度,用于下面实验,细胞被分成四组,SP组,SP+SP受体拮抗剂组(1μmol/1), SP+DKK1组(0.2mg/mL),对照组(等量PBS),每组均在成骨诱导环境下进行培养,培养第4,7,14d用Q-PCR法分别检测各组成骨标志物、Wnt/β-catenin信号转导通路相关基因(C-myc mRNA, cyclin D1mRNA,Lefl,Tcf7及β-catenin mRNA)的表达。同时用Western blot法于培养4,7,14d检测各组C-myc蛋白、β-catenin蛋白表达量,用免疫荧光法于培养4d检测各组β-catenin在细胞中的分布情况。实验结果：1.MC3T3E1细胞呈现多边形或者三角形,茜素红染色显示细胞外基质的钙沉积,碱性磷酸酶染色显示细胞外基质的碱性磷酸酶活性。2. Q-PCR结果显示SP (10-8mol/L,10-9mol/L,10-10mol/L)在成骨诱导液条件下能明显促进MC3T3E1细胞成骨标志物的表达,而以10-8mol/L SP促进作用最为显著。3.10-8mol/L SP能明显促进MC3T3E1细胞成骨标志物、Wnt/β-catenin信号转导通路相关基因的表达,同时能提高C-myc蛋白、β-catenin蛋白的表达,促进β-catenin蛋白在细胞核内分布,SP受体拮抗剂、DKK1能明显抑制SP的这些作用。结论：MC3T3E1细胞具有成骨细胞的部分特性,因此被称为成骨前细胞,10-8mol/L SP在成骨诱导环境下能明显促进MC3T3E1细胞向成骨细胞分化,Wnt/β-catenin信号转导通路可能是其调控机制。