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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus? PRRSV)可引起妊娠母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,编码13个非结构蛋白(Nsp1α,Nsp1β～Nsp12)和6个结构蛋白(GP2、GP3、GP4、GP5、M、N)。猪体感染PRRSV14天后就可以产生针对Nsp7的抗体,而且抗体水平很高,与N蛋白抗体水平相似,但比N蛋白抗体持续时间更长。本研究通过基因重组技术获得Nsp7大肠杆菌重组蛋白,成功构建PRRSV Nsp7间接ELISA抗体检测试剂盒,用于PRRSV免疫抗体的检测和血清学调查,具体内容如下：1. PRRSV Nsp7基因大肠杆菌表达载体构建与稳定性研究采用PCR方法从重组质粒pMD-18T-S Y0608-Nsp7中扩增获得Nsp7全基因,其大小为777bp,将其克隆至原核表达载体pET-28a,成功构建重组表达质粒pET-28a-Nsp7,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导、SDS-PAGE和Western blot鉴定,获得大小约为35KD重组蛋白Nsp7。将重组质粒再次转化大肠杆菌,随机挑取10个阳性克隆菌进行PCR检测,结果都能扩增出特异性条带,随机挑取3个重组表达菌进行诱导表达,结果都能表达出35KD的重组Nsp7蛋白。将重组表达菌连续传代30代,于第5、10、20和30代分别进行诱导表达,均能表达重组Nsp7蛋白,表达产物均能被Nsp7单抗识别,具有良好的免疫原性,表明该重组载体具有较好稳定性。2. PRRSV重组Nsp7蛋白抗原制备与质量检测对重组阳性菌诱导表达条件进行优化,在最佳诱导表达条件下大量表达重组Nsp7蛋白,用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,并对其质量进行检测,结果为：重组Nsp7蛋白最佳诱导表达条件为：菌液起始诱导浓度OD600nm为0.8,加入终浓度为1.0mM的IPTG在37℃诱导6h。纯化后获得的重组Nsp7蛋白经SDS-PAGE电泳方法鉴定,在35KD处有明显的表达带,无明显的杂带。用分光光度计测定纯化的重组Nsp7蛋白浓度,三批重组蛋白平均浓度分别为0.354mg/mL,0.327mg/mL和0.299mg/mL.经ELISA检测,三批重组蛋白的抗原包被浓度均为0.40μg/mL。3. PRRSV阴性和阳性对照血清的制备与质量检测选用PRRSV SY0608毒株第40代病毒液,人工感染4周龄的健康仔猪(抗体检测试剂盒检测为PRRSV、PCV2、CFSV、PRV抗体阴性)制备阳性血清。当ELISA方法检测效价达到1：640以上,无菌采血,获得的血液凝固后离心分离血清。阴性对照血清采自4周龄健康仔猪(抗体检测试剂盒检测为PRRSV、PCV2、CFSV、PRV抗体阴性),ELISA方法检测S/P值<0.4,无菌采血,获得的血液凝固后离心分离血清。鉴此制备30份阴性对照血清和15份阳性对照血清,经过性状检验、无菌检验、PRRSV抗体检验和其它常见猪病原抗体检验均合格。4. PRRSV非结构蛋白Nsp7间接ELISA检测方法的建立用纯化的PRRSV重组Nsp7蛋白包被ELISA酶标板,建立间接ELISA抗体检测方法,对其反应条件进行优化,并与IDEXX公司的PRRSV抗体检测试剂盒进行敏感性、特异性和符合率比较。结果为：抗原最适包被浓度为0.4μg/mL,37℃包被2h,封闭剂为1%BSA,封闭时间为37℃3h,待检血清作用时间为1h,酶标SPA的最佳稀释倍数为1：20,000,37。C作用30min,底物最佳反应时间为37℃作用10min。采用S/P比值作为判定标准,设定阴、阳性对照,根据公式计算S/P值,如果S/P≥0.4,判为阳性；如果S/P<0.3,则判为阴性。该ELISA方法与PCV2、PRV、CSFV、HPS、 EMCV、FMD等其它猪病病原抗体没有交叉反应,与IDEXX公司的PRRSV抗体检测试剂盒比较,其敏感性、特异性及符合率分别为90.0%、95.0%和92.0%。5. PRRSV非结构蛋白Nsp7间接ELISA抗体检测试剂盒组装与质量检测采用3批纯化重组Nsp7蛋白,制备酶标板,确定保存方法,并分别检测30份PRRSV抗体阴性血清,确定阴性对照血清和阳性对照血清及其保存期,组装3批PRRSV抗体检测试剂盒,进行敏感性、特异性和重复性测定。结果为：3批试剂盒与IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒分别检测30份阳性血清,其相对敏感性分别为93.3%、93.3%和90.0%。检测10份阳性血清,抗体效价均达1：640。3批试剂盒同时检测PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪口蹄疫病毒(FMD)和猪脑心肌炎病毒(EMCV)等病原的阳性血清,结果除了PRRSV血清检测为阳性外,其它病原的阳性血清的检测结果均为阴性；同时检测30份阴性血清,结果均为阴性。3批试剂盒进行批次内和批次间重复性试验,批次内的变异系数在3.39%-8.27%,批次间的变异系数在0.47%-7.30%,其值均小于10%。试剂盒在4℃至少可保存8个月。以上结果表明该试剂盒具有较高敏感性、特异性和重复性,可用于PRRSV抗体检测。6. PRRSV非结构蛋白Nsp7间接ELISA抗体检测试剂盒的应用用试制的试剂盒与IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒同时检测168份临床猪血清,两者阳性符合率为91.4%,阴性符合率为96.6%,总符合率为92.3%。用PRRSV活疫苗(R98株)免疫PRRSV阴性健康仔猪,免疫后不同时间分别检测Nsp7抗体和N蛋白抗体产生规律,结果为：PRRSV R98疫苗免疫后2W,可检出Nsp7抗体,并逐渐升高,维持至少100天,而N蛋白抗体产生时间较早,免疫后1W即可产生,维持至70～100天,两者抗体水平基本一致。采用本试剂盒检测996份临床血清的PRRSV抗体,结果为PRRSV血清抗体阳性率为77.21%。以上结果表明本试剂盒可用于PRRSV免疫抗体监测和血清流行病学调查。综上所述,本研究利用重组Nsp7蛋白,成功研制PRRSV非结构蛋白Nsp7间接ELISA抗体检测试剂盒,为PRRSV血清学诊断、免疫抗体检测及流行病学调查提供了简便、快速的检测手段,具有较好的应有前景。