新疆胀果甘总黄酮的制备及抗宫颈癌活性研究

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目的:制备新疆甘草总黄酮提取物,以胀果甘草为主、光果甘草为对照做总黄酮含量测定;观察新疆胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat)种属特异性成分甘草查尔酮A(LicoA)在全草中的分布情况及其含量,并建立LicoA对照品的制备工艺;研究和比较两种新疆甘草提取物的抗宫颈癌活性;初步研制复方胀果甘草宫颈栓,做栓剂的处方及基质筛选。  方法:  1.利用超声辅助的乙醇提取法制备新疆胀果甘草和光果甘草粗提取;分别利用聚酰胺和大孔树脂柱层析法对总黄酮进行精制,并利用紫外分光光度法对总黄酮含量进行测定。  2.利用薄层色谱法以LicoA为对照品,对胀果甘草全草中LicoA进行定性扫描,并利用HPLC法对胀果甘草根和茎中的LicoA进行含量测定。  3.利用硅胶柱层析法进一步从胀果甘草提取物中分离纯化单体成分LicoA,并做LicoA对照品的制备工艺研究。  4.利用MTT法、以顺铂做阳性对照,测定两种甘草的四种提取物(粗品和纯化物)及单体LicoA对宫颈癌SiHa和HeLa细胞在24h、48h及72h的药物干预,测定癌细胞增殖的抑制活性;采用流式细胞仪法测定对宫颈癌细胞的促凋亡作用,以验证MTT结果。  5.以胀果甘草提取物为主成分,制备宫颈栓,并做质量鉴定研究。  结果:  1.胀果甘草及光果甘草粗提取所含的总黄酮含量分别为5.6%和3.6%;两种甘草精制提取物中总黄酮含量分别为56.4%和49.7%;根据薄层鉴定结果可观察到LicoA的特殊斑点只存在于胀果甘草根和茎的提取物中,而不存在于叶和种子的提取物。  2.利用HPLC法测得的胀果甘草根和茎的提取物中LicoA含量分别为0.468%和0.254%。  3.用不同柱层析方法分离纯化得到LicoA对照品的产率分别为3.37mg/g(聚酰胺纯化)、3.05mg/g(大孔树脂纯化)、3.56mg/g(硅胶纯化)。  4.两种甘草的四种提取物显示不同强度的抑制宫颈癌细胞增殖的活性,其中胀果甘草精制提取物的抑制活性明显强于光果甘草,其浓度在25~175μg/mL范围内对宫颈癌SiHa和HeLa细胞抑制率分别为10.7%-92%和13.1%-93.7%,呈明显的浓度依赖性及时间依赖性,与相应浓度的光果甘草提取物的活性差异有统计学意义。胀果甘草精制提取物浓度在100μg/mL及125μg/mL时对宫颈癌HeLa和SiHa细胞的促凋亡作用分别为38.7%和26.9%。  5.初步研制胀果甘草宫颈栓制剂,并以黄酮类化合物的性质为主进行鉴定、并建立初步的质量标准,考察和筛选栓剂基质的配伍比例。  结论:  1.两种甘草中,新疆胀果甘草中的总黄酮含量高于光果甘草;聚酰胺连用大孔树脂法纯化甘草总黄酮的效果要比反复利用聚酰胺纯化的方法高,总黄酮的纯度较高,易达到总黄酮含量为50%的中药提取物标准。  2.LicoA在甘草中主要分布在胀果甘草根和茎中,根中的含量高于茎中,本研究首次提出胀果甘草茎也可作为获取LicoA新资源;反复利用硅胶柱层析分离纯化方法可用于实验室高效制备LicoA对照品。  3.两种新疆甘草粗提物及纯化物在一定浓度范围内对两种宫颈癌细胞显示较显著的抑制增殖及促进凋亡作用,其中,胀果甘草总黄酮提取物的抗宫颈癌活性显著高于光果甘草总黄酮。本研究结果为新疆胀果甘草资源的深入研究及开发利用奠定重要基础。
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