研究背景和目的自20世纪60年代Branemark教授提出“骨结合(Osseointegration)"理论,并于1965年首次使用钛金属牙种植体植入人类颌骨完成牙缺失修复至今,钛种植体作为口腔牙列修复的种植材料获得了飞速的发展和广泛的应用。现在,口腔种植修复作为一门理论成熟的技术,已经取得了令人满意的临床修复效果,大大改善了牙列缺损或缺失患者的生活质量,成为了牙列缺损和牙列缺失的首选治疗方案。种植体的功能特征主要体现在种植体与骨之间的接触界面。良好的种植体表面特征对骨结合的发生和形成起着至关重要的作用。Davies JE[3]的研究结果显示,种植体经过表面处理后其骨引导性将有所提高,能更好地吸附蛋白、细胞和细胞因子,发生接触成骨,实现双向成骨的骨愈合模式,故可以有效地促进骨结合。与传统的光滑机械加工表面相比,具有合适粗糙度的纯钛种植体表面将有利于成骨细胞的粘附、增殖、分化和矿化。各国学者对此进行了大量的研究,其研究结果与本课题组的前期研究结果相似,同样显示了种植体的表面理化特征和生物学特性不仅可以决定骨组织细胞的附着、增殖和分化,而且在很大程度上决定了种植体与骨界面的愈合速率。因此,通过对钛种植体进行适当的表面处理,可以提高材料的理化特性、生物活性和骨引导性,甚至可以使其获得骨诱导性,从而达到促进骨结合、缩短临床愈合时间和种植体长度以及维持功能负重后的长期稳定性等良好效果。目前,种植体的表面粗化处理方法主要有：1.表面加成法：钛浆喷涂(Titanium plasma spray, TPS)涂层、羟基磷灰石(HA)涂层等；2.表面减去法：喷砂结合酸蚀(Sandblasting with large grit and acid-etching, SLA)、双重酸蚀、电子束热处理、激光处理等；3.表面氧化法：阳极氧化(Anodic oxidation, AO)、微弧氧化(Micro-arc Oxidation, MAO)等[12-14]。这些方法都在表面形貌、元素组成、分子结构、电荷状态、表面自由能、亲疏水性特性等方面进行了不同程度上的改性,从而改变了种植体表面的生物学特性,进而影响到种植体与宿主之间复杂的生物学效应。例如现今流行的SLA表面处理技术,在大颗粒喷砂获得10-30μm孔洞并形成一级粗糙度的基础上,加以混合酸高温酸蚀来添加1～3μm微孔形成二级粗糙度,一级粗糙度类似于骨陷窝有利于成骨细胞的附着,二级粗糙度可以刺激成骨细胞增殖分化,故这种多级立体表面形貌有利于骨结合的形成,并在体外测试中获得良好的扭矩值[15-18]。由此可见,粗化表面处理是经临床证实的有效表面处理方式,其可以使得种植体表面获得良好的形态学特性。但是,传统的SLA表面在制备完成后被置于空气中干燥,从而使得表面成为疏水性。疏水性表面将会阻碍液体在表面铺展,而亲水性表面则很容易被液体润湿,并同时可以增强与周围生物环境的反应,如增加蛋白的吸附和成骨细胞的生物学行为[19-21]。因而,需要对SLA表面进行进一步的改良。在保持SLA表面的良好三维多级孔洞形态特征的基础上,喷砂酸蚀纯钛表面完成后被保存在液体中,避免了空气中碳氢化合物的污染,从而获得了亲水性的改良SLA(modified SLA, modSLA)表面,经实验证明,该表面可以促进成骨基因的表达、成骨细胞的分化和矿化以及早期骨结合[22-25]。因此,在保持种植体这种良好的宏观粗化表面的基础上,需要再进一步对种植体表面进行活化处理,微观修饰则是追求最大化的优化种植体生物学活性的重要手段。其中,作为种植体表面重要特征的表面自由能(Surface free energy,SFE)则是粗化表面微观修饰的重要研究方向和内容。在相同表面形态下,具有不同SFE的材料表面可以表现出不同的生物学活性。国内外学者已对不同SFE表面的生物学特性进行了实验研究。Textor等提出,与水相似的清洁且亲水的二氧化钛表面是由二氧化钛的羟化或水化并且被水高度润湿造成的,这使得该表面可以与含有蛋白等活性分子的水层进行合适的相互作用。NygrenH[29]的实验结果显示,与全血接触的过程中,高SFE的亲水性表面粘附了更高浓度的补体C1、凝血酶、凝血酶原,血小板较少；而低SFE的疏水性表面则粘附有较多的纤维蛋白原和血小板。而Pesskova[30]的研究中,表面能中的极性成分将影响到蛋白和细胞的反应,其中极性成分高的表面,具有较高的细胞密度和较低的炎症细胞因子产物,但没有纤维形成,而具有较低极性成分的表面则具有较高的炎症介质表达和较低细胞增殖,但在凝血中有较快的纤维形成。Hallab[31]的研究显示细胞在金属材料上的粘附率与材料的SFE成正比。Zhao[27,32]等人的实验结果认为,高SFE的Ti02表面可以使成骨细胞表达更高的ALP和OC活性,生产更多的PGE2和TGF-β1,并且发现纯钛表面的SFE与大气中碳氢化合物相关。因此,有效提高种植体表面的SFE,获得亲水性粗糙表面,将更利于成骨细胞的生物学行为以及骨结合的发生、形成以及长期的稳定。SFE的大小取决于材料表面形态结构、元素组成、电荷状态等。实验证实,不同的表面处理方法在改变材料表面形态结构、元素组成、电荷特征的同时,也会导致SFE发生变化。碳氢化合物污染可以使得纯钛SFE和亲水性下降,甚至疏水,而酸蚀、碱热处理、光化学催化、羟基化等处理方法则可以增加SFE和亲水性,甚至形成超亲水性表面。其中,光化学催化反应是改性半导体材料,提高其SFE并获得超亲水特性的一种简单、方便和高效的方法。光催化反应,又称“本多-藤岛反应”,是日本的本多健一和藤岛昭两位学者发现的。该反应的光化学催化剂大多是硫族化合物半导体(目前以TiO2使用最为广泛),其都具有区别于金属或绝缘物质的特别能带结构,即在价带(ValenceBand, VB)和导带(Conduction Band, CB)之间存在一个禁带(Forbidden Band,FB)。由于半导体的光吸收阈值与带隙具有以下的关系,K=1240/Eg(eV),因此,常用的宽带隙半导体的吸收波长阈值大都在紫外区域。当光子能量高于半导体吸收阈值的光照射半导体时,半导体的价带电子发生带间跃迁,即从价带跃迁到导带,从而产生光生电子(e-)和空穴(h+)。此时,吸附在催化剂表面的溶解氧俘获电子形成超氧负离子,而空穴将吸附在催化剂表面的氢氧根离子和水氧化成氢氧自由基。而超氧负离子和氢氧自由基具有很强的氧化性,能将绝大多数的有机物氧化至最终产物C02和H20,甚至对一些无机物也能彻底分解。当光照结束时,光生电子将在瞬间复位到空穴中,并在材料表面留下大量的亲水性基团-OH,从而在降低材料表面碳氢化合物污染的同时,最终使其获得了超亲生特性。近期,紫外线(Ultraviolet, UV)辐照被应用于种植体表面处理以获得超亲水特性。研究显示,与单一的表面处理技术相比,纯钛表面附加UV辐照后显示出更佳的生物活性[33-37]。另外,相关的实验表面,由于碳氢化合物污染的增加,纯钛酸蚀表面的生物活性将随着时间的迁移而发生老化[38]。有趣的是,那些由于长时间存放而老化的种植体在受到UV辐照后,其表面活性得以复活,并同时获得亲水特性,促进了蛋白吸附、成骨细胞粘附、增殖、分化和矿化,甚至骨结合,显示出良好的生物活性[39-42]。但是,至今为止,国内外仍然缺乏关于纯钛SLA表面复合UV辐照处理的相关研究,对纯钛UV-SLA表面进行科学的生物学实验测试,将可以更好地探讨SLA处理和UV辐照这两种表面改性技术的有机结合,能否在保留喷砂酸蚀良好形貌特征的基础上,进一步优化材料的生物活性,以最终提高种植体表面的生物活性,促进骨结合的形成。因此,本研究将对SLA、modSLA和UV-SLA三种表面进行比较,通过表面理化性能分析、MG63成骨细胞体外生物活性检测以及模拟体液(Stimulated body fluid, SBF)体外矿化诱导实验来检测UV-SLA表面的生物活性,以为纯钛种植体表面复合UV辐照技术的实现提供一定的理论依据和实验基础。方法1.实验样品的制备：通过严格选择和控制表面处理过程中的各种参数,结合喷砂、酸蚀、水体保存、UV辐照等技术,制备出相对一致、重复性可、具有特征性的多级孔洞形貌及适中粗糙度的SLA、modSLA和UV-SLA表面。2.理化性能的检测：通过扫描电子显微镜、光学干涉轮廓仪、X线光电子能谱仪和接触角测量仪分别对SLA、modSLA和UV-SLA表面的形貌特征、粗糙度、元素成分以及润湿性进行检测,以其评估不同处理组表面的理化性能特性。3.MG63成骨细胞体外生物活性检测：通过MG63成骨细胞培养,扫描电子显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察,细胞粘附率、增殖率、分化以及矿化测试,来检测MG63成骨细胞在SLA、modSLA和UV-SLA表面上的生长形态、粘附率、增值率、分化以及矿化的情况,以评估不同处理组样品表面的体外细胞生物活性。4.SBF体外矿化诱导能力检测：通过对SLA、modSLA和UV-SLA表面在SBF中浸泡诱导1w、2w、3w和4w后沉积矿化物的质量、形态、成分和晶相的检测,来评估不同处理组样品表面的体外矿化诱导能力。统计学处理实验数据以均数±标准差(x±s)来表示。样本量n=3。应用SPSS v13.0软件(SPSS Inc., Chicago, USA)进行统计分析。数据经过正态分布和方差齐性检验后,以析因设计方差分析来检测处理因素的主效应、交互作用,再分别使用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Bonferroni检验或两独立样本t检验来进行整体和组间的比较。当正态分布但方差不齐时,则分别使用Welch检验和Dunnet’s T3检验或两独立样本t’检验来进行整体和组间的比较。当非正态分布和／或方差不齐时,则分别应用Kruskal-Wallis H非参数检验和Nemenyi多重比较来分析数据的整体和组间差异。假设检验为双侧检验,检验水准为0.05。当P<0.05时,差异被认为具有统计学意义。当P<0.01时,差异被认为具有显著性统计学意义。结果1.通过严格选择和控制表面处理过程中的各种参数,制备出相对一致、重复性可、大小与外观均与预期设计相符的粗糙SLA、modSLA和UV-SLA表面。2.理化性能分析显示,SLA、modSLA和UV-SLA表面均具有相似的三维立体多级孔洞形貌10-30μm的大孔和1-3μm的微孔)和中等粗糙度(Sa约为2.43μm)。但其碳氢化合物含量、润湿性以及SFE存在差异。与低SFE(23.16mN/m).且疏水的SLA表面(32.01%At C)相比,modSLA表面(25.31%At C)和UV-SLA表面(14.26%At C)皆具有亲水性和高SFE(74.06mN/m),而且UV-SLA表面获得了大量的亲水性基团-OH(60.90%At O)。3.MG63成骨细胞体外生物活性检测显示,MG63成骨细胞在各组样品表面的生长形态良好。与疏水性SLA表面相比,亲水性nodSLA表面更能显著地增强MG63成骨细胞在样品表面14d的矿化(P<0.01)。而超亲水性UV-SLA表面,则最大程度地促进了MG63成骨细胞的粘附(24h)、增殖(7d)、分化(14d)和矿化(14d),与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05or P<0.01)。4.体外矿化诱导能力检测显示,UV-SLA表面在矿化诱导3w时,其沉积矿化物的质量要高于1modSLA和SLA表面(P<0.05),到4w时,UV-SLA和modSLA表面沉积的矿化物大量增加,具有较高的钙磷比,并覆盖了整个样品表面,分别达到3.23±0.35mg和2.13±0.95mg,约为SLA表面(0.43±0.15mg)的8倍和5倍,且差异具有统计学意义。XRD分析矿化沉积物的成分为磷灰石。结论碳氢化合物污染是影响人工材料生物活性的一个重要因素。dH20保存可以有效地维持粗糙表面的生物活性,而UV辐照处理则是一种在不改变表面形貌和粗糙度的基础上,有效地分解碳氢化合物污染,并增强喷砂酸蚀纯钛表面生物活性的良好表面处理技术。