研究背景:糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是一种代谢性疾病,不健康的生活方式如长期高脂或高糖饮食可导致肠道慢性低度炎症反应,改变肠道菌群结构,从而促进代谢性内毒素血症和肠上皮粘膜损伤。此外,晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products,AGEs）的蓄积作为糖尿病的重要发病机制可以导致氧化应激损伤,引起细胞功能障碍甚至细胞死亡,继而导致糖尿病相关多器官功能损伤。在肠上皮中分布着肠道内分泌细胞,可以分泌胰高血糖素样肽-1（Glucagon-likepeptide-1,GLP-1）和糖依赖性促胰岛素释放多肽（Glucose-dependentinsul inotropic polypeptide,GIP）等物质,统称之为“肠促胰素”（incretins）。肠促胰素可以通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高糖素分泌、促进胰岛β细胞增殖等机制改善胰岛素功能,维持血糖稳态。在机体处于糖尿病和衰老等状态下时,体内AGEs大量产生和积聚,则可导致肠促胰素分泌功能受损,继而促进糖尿病及其并发症的发生发展。乳脂肪球表皮生长因子 Ⅷ（Milk fat globule epidermal growth factor Ⅷ,MFG-E8）是一种可在多种组织及细胞中表达的外周膜糖蛋白,具有多种生物学活性的。近年来的研究发现,除了介导凋亡细胞的清除外,MFG-E8还在抑制炎症、促进伤口愈合、动脉血管壁重建、缺血再灌注损伤等方面发挥了众多作用。此外,MFG-E8在肠道粘膜屏障损伤及修复中也扮演着重要作用。在脓毒血症或者右旋糖酐硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）诱导的结肠炎小鼠模型中,外源性重组人MFG-E8（rhMFG-E8）可以抑制损伤模型中炎症因子的释放,并维持肠粘膜稳态和修复肠上皮粘膜屏障。Amitava等人发现高糖状态以及暴露于AGEs状态下可以抑制MFG-E8活性,继而导致糖尿病患者伤口愈合功能受损,而rMFG-E8则可以抑制炎症并促进皮肤伤口愈合。MFG-E8似乎有益于糖尿病相关炎性损伤的修复,但其具体作用机制尤其是在肠道中的作用需要进一步探讨。受体相互作用蛋白激酶（Receptor interacting protein kinase,RIPK）是程序性坏死途径的关键分子,在维持组织稳态尤其是肠道屏障功能和肠内稳态方面发挥着重要作用。最近研究表明,通过释放细胞损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns,DAMPs）,RIPK1-RIPK3-混合谱系激酶结构域样（Mixed lineage kinase domain-like,MLKL）可通过非坏死依赖性机制驱动炎症反应性疾病,进而导致组织损伤。因此,针对RIPKs激酶的抑制可能是炎性疾病的潜在治疗靶点。基于前期研究,我们拟通过建立链脲佐霉素诱导的糖尿病小鼠肠道损伤模型及糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）诱导的肠上皮内分泌细胞损伤模型,来探讨MFG-E8和RIPKs相关信号通路间的分子连接机制,并利用D-松醇（一种具有抗炎、降糖和抗氧化能力的天然化合物）作为该模型中的保护剂,来初步探讨MFG-E8在糖尿病相关肠道炎性损伤中的可能机制及对GLP-1分泌的影响。研究目的:本课题通过观察糖尿病小鼠肠道炎性损伤模型及AGE-BSA诱导的小鼠肠上皮内分泌L细胞（STC-1）糖基化损伤模型中MFG-E8及损伤相关分子模式的表达变化,探讨MFG-E8是否通过RIPK1/RIPK3/MLKL通路调节糖尿病肠道炎症反应,继而可能影响肠道上皮内分泌功能。研究方法:一、体内研究部分1.模型的建立及分组12周龄SPF级雄性衰老抵抗正常小鼠（SAMR1）及同周龄雄性快速老化小鼠（SAMP8）各22只分别随机分为2组:对照组（等量柠檬酸缓冲液腹腔注射,10只/组）及糖尿病组（STZ腹腔注射50mg/kg/d,12只/组）,每次禁食12h后腹腔注射造模,连续注射5天,2周后尾静脉采血,以所测定空腹血糖≥16.7mmol/L确定为建模成功,后每周检测空腹血糖及体重。2.标本留取及检测造模成功4周后处死小鼠,留取外周血、回肠末端组织,肠道组织标本一份给予4%多聚甲醇固定后石蜡包埋切片作病理检测,另一份-80℃冷冻保存待Western blot和PCR检测。对回肠组织连续切片,厚度大约4μm,采用HE染色观察肠道组织形态,免疫组化染色观察肠道组织中MFG-E8蛋白表达量,Western blot检测MFG-E8、p-MLKL及HMGB1蛋白表达,RT-qPCR检测肠道组织中肠促胰素相关基因Gcg、Pcsk1 mRNA以及促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA的表达。二、体外研究部分1.AGEs诱导STC-1细胞炎性损伤模型建立体外培养肠上皮内分泌L细胞（STC-1）,分别给予不同浓度的AGEs（0,100,200,300,400μg/ml）干预24-48h,以及给予不同浓度D-松醇（40,60,80μM）预处理后再加入AGEs 200μg/ml继续培养24-48h。分别采用MTT法、Hoechst33342/PI双染以及Annexin V/PI流式细胞术检测细胞活力及细胞坏死情况。Western blot检测MFG-E8蛋白表达情况。应用酶联免疫吸附测定技术（ELISA）检测细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、损伤相关分子模式因子HMGB1及GLP-1表达水平。2.MFG-E8沉默及过表达干预机制研究通过MFG-E8 siRNA及过表达质粒转染STC-1细胞,联合AGEs干预处理。应用Western blot、ELISA、流式细胞学、免疫细胞化学染色等技术,检测各组细胞坏死及炎症因子表达情况,检测上清液中GLP-1分泌水平变化,并检测RIPK1/RIPK3/MLKL通路蛋白的表达水平。三、统计分析方法计量资料数据的结果以均数±标准差/标准误的方式表示,采用单因素方差分析进行多组间的差异比较,采用非配对的t检验法进行两组间的差异比较分析。使用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8进行数据分析和柱状图绘制。所有检验均为双侧检验,以P＜0.05认为差异具有统计学意义。研究结果:一、体内研究部分1.小鼠体重、血糖变化及肠道病理改变STZ诱导的SAMR1及SAMP8糖尿病小鼠均出现血糖升高、体重下降及多饮、多食、多尿现象。与对照组相比,SAMR1/SAMP8糖尿病小鼠肠道上皮绒毛结构紊乱,绒毛顶部变钝而粗短,部分绒毛坏死脱落,绒毛高度与隐窝深度比值下降。此外,肠道上皮GLP-1转录相关基因Gcg及Pcsk1 mRNA表达下调（P＜0.05）。2.小鼠肠上皮组织MFG-E8蛋白及p-MLKL、HMGB1蛋白表达变化免疫组化染色及Western blot结果显示,高糖状态下SAMR1/SAMP8小鼠肠道上皮MFG-E8蛋白表达明显下调,且MFG-E8在肠道绒毛的表达由隐窝位置移行至绒毛顶部。由于观察到肠道粘膜损伤表现,我们进一步检测坏死通路相关标记物p-MLKL及HMGB1蛋白表达,结果显示STZ 诱导的SAMR1/SAMP8糖尿病小鼠肠道上皮组织p-MLKL及HMGB1的表达均增高,并伴有肠道上皮促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA表达的显著升高（P＜0.01）。二、体外研究部分1.MFG-E8在STC-1细胞糖基化损伤中的表达变化及D-松醇的保护作用MTT检测不同浓度D-松醇对AGEs诱导下STC-1细胞增殖活性的影响,结果显示不同浓度AGEs（0,100,200,300,400 μg/ml）刺激后,细胞存活率呈浓度依赖性下降,而提前给予D-松醇预处理则可减轻AGEs对细胞活性的抑制作用。进一步通过Hoechst33342/PI染色及流式细胞学检测细胞坏死情况,可看到AGEs刺激可诱导细胞部分发生坏死,而给予不同浓度的D-松醇预处理则可以观察到细胞坏死的减轻。此外,外源性AGEs刺激后,STC-1细胞中MFG-E8蛋白表达下降,并伴有细胞上清液中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和损伤相关分子模式因子HMGB1表达的增高,而给予D-松醇预处理后则可以观察到MFG-E8蛋白表达的上调及上述炎症相关因子表达的下降（P＜0.05）。2.MFG-E8在STC-1细胞炎性损伤中的分子调控机制该部分通过MFG-E8沉默及过表达质粒转染STC-1细胞,进一步来探讨其在STC-1炎性损伤中的可能机制。结果显示,MFG-E8沉默后,STC-1细胞活性下降,并伴有细胞坏死的增加及细胞上清中HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6表达的增高,在此过程中,GLP-1的分泌功能受抑制;而MFG-E8过表达则可以减轻AGEs对细胞活性的抑制作用及减少细胞坏死的发生,且GLP-1的分泌功能有所恢复。ELISA结果显示MLKL通路的抑制可以影响下游炎症因子的表达。进一步通过在MFG-E8沉默或过表达的STC-1细胞中检测RIPK1/RIPK3/MLKL通路蛋白的表达,结果发现,MFG-E8沉默及AGEs干预均可以激活RIPKs通路,而MFG-E8过表达则可以减轻AGEs对RIPKs通路的激活作用,提示MFG-E8很可能通过RIPKs通路调节下游坏死相关炎症反应。研究结论:1.高糖状态可导致小鼠肠上皮粘膜损伤及MFG-E8表达下降,伴随坏死相关MLKL通路的激活及GLP-1分泌功能的受损。2.AGEs通过诱导STC-1细胞坏死相关炎症反应,损伤肠上皮内分泌细胞功能,而D-松醇则具有一定保护作用。3.MFG-E8在肠道内分泌L细胞中可能通过RIPK1/RIPK3/MLKL通路抑制AGEs诱导的坏死相关炎症反应的发生,继而可能对肠上皮内分泌功能具有保护作用。