研究背景糖尿病包含两种基本类型,1型糖尿病常继发于胰岛p细胞的自身免疫损伤,2型糖尿病(type Ⅱ diabetes mellitus, DM Ⅱ)在新发病例中占据大多数,最初表现为胰岛素抵抗,随着胰岛素需求量的增高,胰岛慢慢衰竭,导致血糖升高。糖尿病的并发症包括心脏病变,高血压,视网膜病变,神经病变,肾脏病变等。在泌尿系统的并发症中,膀胱功能障碍非常普遍,在糖尿病病人中大约占80%,临床症状主要表现为膀胱粘膜感觉受损,残余尿增多以及逼尿肌过度活动症。尽管糖尿病膀胱功能障碍并不危及生命,但严重影响了病人的生活质量,并且目前尚无有效的治疗方式。传统的治疗方法,例如药物治疗和手术治疗,由于效果欠佳,易复发,术后易导致排尿困难等原因很少采用。脂肪来源干细胞(adipose tissue derived stem cells, ADSCs)是一种在脂肪组织血管周围发现的间充质干细胞,类似于骨髓间充质干细胞,具备多向分化的能力。在既往的实验研究中,研究人员发现ADSCs在能够促进肥胖致下尿路症状的恢复,能够修复大鼠受损的盆腔神经节,能够促进海绵体神经受损致勃起功能障碍的修复,并且由于ADSCs存量丰富并且易获取,其已经成为应用研究前景广阔的组织修复材料。尽管在动物实验中发现,移植的ADSCs能够分化成为受损处的组织细胞类型,但目前认为旁分泌途径是ADSCs发挥治疗作用的主要途径。将ADSCs裂解液注入双侧海绵体神经受损的大鼠阴茎海绵体后,勃起功能较对照组有明显改善就很好的支持了上述观点。目的制造DM Ⅱ膀胱功能障碍的大鼠模型,探讨ADSCs移植在糖尿病膀胱功能障碍中的治疗作用及治疗机制。材料与方法1.动物实验(1)实验设计39只雌性8周龄的Sprague-Dawley大鼠,随机分组如下：正常对照组：喂养普通食物(n=10只)；糖尿病组：首先喂养高脂肪食物1个月,然后腹腔注射两次低剂量的链脲佐菌素(30mg/kg, streptozotocin, STZ),高脂肪食物继续喂养至实验结束(n=29只)。STZ腹腔注射3个月后所有实验大鼠进代谢笼检测并行胰岛素抵抗检测,然后行腹腔手术取出脂肪组织进行ADSCs的分离和增殖培养,并用10μM5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU)标记。然后向正常对照组大鼠的膀胱壁注射1ml平衡盐溶液(N+PBS组,n=10只),糖尿病组中的29只大鼠随机分为3组：第1组：膀胱壁注射1ml平衡盐溶液(DM+PBS组,n=9只)；第2组：通过尾静脉注射自体ADSCs(DM+T组,n=10只)；第3组：膀胱壁注射自体ADSCs(DM+B组,n=10只)。ADSCs移植1月后,对所有大鼠进行清醒状态下膀胱内压的检测,最后处死进行组织学检查。(2)代谢笼检测STZ注射3个月后,所有大鼠行24h代谢笼检测实验,所有大鼠在代谢笼中均自由饮食,它们的尿的频率和尿量经过计算机软件记录。(3)胰岛素抵抗实验代谢笼检测完毕后,所有的实验大鼠进行胰岛素抵抗实验的检测。通过腹腔注射1IU/Kg胰岛素,然后在0,15,30,60,90和120分钟分别检测大鼠血糖值。(4) ADSCs的分离培养、标记并注射采用酶消化法将ADSCs从脂肪分离,并在DMEM低糖培养基中,在37℃,5%CO2的细胞培养温箱内培养。注射前在含有10μM EdU的培养基中过夜标记。然后向N+PBS组和DM+PBS组大鼠膀胱壁内注射1ml的平衡盐溶液,向DM+B组大鼠膀胱壁内注射3×106个ADSCs,向DM+T组大鼠尾静脉内注射3×106个ADSCs.(5)清醒状态膀胱内压测定ADSCs移植1月后,对所有实验大鼠进行清醒状态下膀胱内压的检测。第1条聚乙烯-90导管置入膀胱检测膀胱内压,第2条导管置入腹腔检测腹内压,待膀胱活动稳定后持续检测1小时。(6)血生化的检测大鼠处死后,利用含肝素的离心管收集1ml从下腔静脉抽取的血液,离心后收集上层血浆。然后利用酶联免疫反应试剂盒分别检测血浆胰岛素、甘油三酯、高密度脂蛋白、低/极低密度脂蛋白的浓度。(7)免疫荧光染色和免疫组化染色大鼠膀胱组织经2%冰甲醛固定4小时后进行包埋并且进行冰冻切片,切片风干后进行免疫荧光染色和免疫组化染色。一抗包括小鼠抗平滑肌肌动蛋白抗体(smooth muscle actin, SMA),兔抗胶原蛋白Ⅳ抗体(Collagen Ⅳ, Col Ⅳ),羊抗尿路上皮跨膜蛋白Ⅱ抗体(Uroplakin Ⅱ, UP Ⅱ),小鼠抗大鼠内皮细胞抗原-1抗体(rat endothelial cell antigen-1, RECA-1),小鼠抗基质细胞衍生因子-1抗体(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)。然后,RECA-1的染色经过抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物技术(avidin-biotin-peroxidase complex, ABC)完成。其余染色经结合Alexa fluor488或者Texas red的二抗孵育。另外,SMA染色也经过鬼笔环肽(Phalloidin)室温下孵育20分钟完成。我们利用Click-IT反应试剂盒染色来追踪EdU标记的ADSCs。(8)膀胱组织细胞凋亡的定量及EdU标记ADSCs在膀胱组织中的定量膀胱组织切片中凋亡细胞染色采用TUNEL试剂盒,TUNEL染色后在荧光显微镜下利用Image Pro Plus软件计算凋亡细胞的数目。EdU标记ADSCs在膀胱组织中的定量是通过计算ADSCs在一个组织切片中的数目与膀胱可切切片数目的乘积获得。2.细胞实验(1)条件培养基的制备将大鼠ADSCs种植于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培养基中,当覆盖率达90%后,将培养基置换为不含血清的DMEM,24小时后收集培养基,离心后-80℃保存备用。大鼠阴茎平滑肌细胞(penile smooth musclecells, PSMCs)条件培养基作为阴性对照。人ADSCs和PSMCs条件培养基制备方法同上。(2)大鼠ADSCs分泌血管内皮生长因子的定量利用酶联免疫反应(ELISA)检测大鼠ADSCs条件培养基中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的含量,大鼠阴茎平滑肌细胞条件培养基作为阴性对照。(3)人脐静脉内皮细胞,大鼠膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞的培养将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植于6孔细胞培养板内,然后分别加入4种不同的培养基培养48小时：正常葡萄糖含量的普通培养基(NG组),高糖的普通培养基(HG组),高糖的人阴茎平滑肌细胞的条件培养基(HG+PSMCs CM组),高糖的人ADSCs的条件培养基(HG+ADSCs CM组)。同上,利用大鼠阴茎平滑肌细胞和ADSCs的条件培养基培养大鼠膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞。(4)毛细血管样管形成实验将上述培养的HUVECs种植在预先用低生长因子基质胶覆盖的12孔板内,并继续用上述不同的培养基培养16小时。然后在显微镜下观察各组毛细血管样管形成的数量。(5)培养细胞中发生凋亡的检测上述培养的大鼠膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞用TUNEL试剂盒进行染色,然后在荧光显微镜下观察凋亡细胞发生的情况。同时利用流式细胞仪对凋亡细胞进行定量检测。(6)RNA提取和实时定量PCR上述培养的大鼠膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞中的RNA利用RNAeasy Isolation试剂盒进行提取。逆转录后,大鼠Caspase-3基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)利用Applied Biosystems’PRISM7300HT序列检测系统进行实时定量PCR的检测。3.统计学分析使用Prism5软件对各组实验数据进行统计学检验。各组之间连续性数据的比较使用单因素方差分析检验。Post-hoc比较使用Tukey-Kramer检验。利用Fisher卡方精确检验比较各组中ADSCs移植后膀胱功能改善情况。p<0.05表示具有显著性差异。所有数值用平均值±标准差表示。结果1.2型糖尿病大鼠模型制造糖尿病组中的大鼠平均体重较正常对照组明显增加,胰岛素敏感性下降,血浆胰岛素轻微下降,血糖明显升高。代谢笼检测结果显示糖尿病组大鼠的24h饮水量,排尿次数,每次排尿量较正常对照组显著增高(p<0.001)。2.清醒状态膀胱内压测定N+PBS组中的大鼠(n=10)表现为正常的排尿曲线,每30分钟排尿8-9次,排尿时膀胱内压峰值38.9±9.3cmH2O,每次排尿0.4±0.14ml。部分DM+PBS组中的大鼠(n=6)排尿曲线异常,表现为每30分钟排尿1-2次,排尿时膀胱内压峰值50.0±10.8cmH2O,每次排尿3.74±1.09ml。另外,1只DM+PBS组中的大鼠(n=1)表现为无收缩性排尿曲线,2只DM+PBS组中的大鼠(n=2),2只DM+T组中的大鼠(n=2),1只DM+B组中的大鼠(n=1)表现为不稳定膀胱排尿曲线。在注射ADSC的大鼠中,分别有40%的DM+T组中的大鼠和60%的DM+B组中的大鼠的排尿曲线表现为正常曲线,较DM+PBS组(0%)有显著升高(p<0.05)。3.EdU阳性细胞的追踪在ADSC注射1个月后,EdU染色结果发现在膀胱粘膜下层组织和肌层中存在EdU阳性的细胞。其中部分EdU阳性细胞表现为SMA阳性。在DM+T组中,肌层与粘膜下层EdU阳性的细胞数目分别为4.7±2.1×103和10.2±3.8×103。在DM+B组中,肌层与粘膜下层EdU阳性的细胞数目分别为5.6±2.9×103和14.9±5.0×103。DM+T组中大鼠膀胱组织中可见SDF-1阳性细胞。4.细胞凋亡的定量在膀胱组织切片中,细胞凋亡主要发生在膀胱粘膜层和肌层。DM+PBS组中的细胞凋亡数目明显多于N+PBS组(p<0.05)。ADSC注射后,粘膜层细胞凋亡数目显著减少(p<0.05),而肌层细胞凋亡数目没有明显改变(p>0.05)。在培养的大鼠尿路上皮细胞中,流式细胞术结果显示HG组中发生凋亡的细胞比例(30.3%±9.9%)较NG组中(5.1%±0.8%)显著升高(p<0.001)。HG+ADSCsCM组中发生凋亡的细胞比例(10.1%±2.7%)较HG组显著下降(p<0.001)。HG+PSMCsCM组中发生凋亡的细胞比例(33.4%±8.1%)与HG组无显著差别(p>0.05)。在培养的大鼠膀胱平滑肌细胞中,流式细胞术结果显示HG组中发生凋亡的细胞比例(19.1±4.9%)较NG组中(1.6±0.7%)显著升高(p<0.001)。HG+ADSCsCM组中发生凋亡的细胞比例(10.3±4.6%)较HG组显著下降(p<0.05)。HG+PSMCsCM组中发生凋亡的细胞比例(20.0±9.8%)与HG组无显著差别(p>0.05)。实时定量PCR结果显示,培养的大鼠尿路上皮细胞中,HG组的Caspase-3表达量较NG组显著升高(p<0.001),HG+ADSCsCM组较HG组显著降低(p<0.01),HG+PSMCsCM组与HG组无显著差别(p>0.05)。培养的大鼠膀胱平滑肌细胞中,HG组的Caspase-3表达量较NG组显著升高(p<0.01),HG+ADSCsCM组较HG组显著降低(p<0.05),HG+PSMCsCM组与HG组无显著差别(p>0.05)。5.血管密度的定量在正常大鼠膀胱的粘膜下层可见连续致密的Col IV阳性的毛细血管网络。而在DM+PBS组中,此毛细血管网络失去连续性,数目减少或缺失。在DM+T和DM+B组中,毛细血管网络的连续性较ADSCs注射前明显改善。与DM+PBS组相比,N+PBS组,DM+T组和DM+B组中膀胱粘膜下层可见大量的RECA-1阳性细胞。ELISA结果显示ADSCs条件培养基中(652.1±140.3pg/ml) VEGF的含量较对照细胞PSMCs条件培养基中(348.8±96.7pg/ml)显著增加(p<0.05)。毛细血管样管形成实验结果显示,HG+ADSCsCM组中HUVECs形成毛细血管样管的能力较HG组显著增加(p<0.01),而HG+PSMCsCM组无明显改变(p>0.05)。结论1.成功建立了DM Ⅱ膀胱功能障碍的大鼠模型,并且此模型表现的生理特征和膀胱功能受损情况与晚期DBD相似。2. ADSCs能够促进大鼠模型膀胱功能的恢复。3. ADSCs可以通过其分化功能(如分化为SMCs)发挥治疗作用,但是最主要的途径为旁分泌功能。4.抑制细胞凋亡和促进血管形成是ADSCs治疗过程中的重要的反应。意义本项研究首次在2型糖尿病大鼠模型中,利用移植ADSCs的方法来治疗糖尿病导致的膀胱功能障碍,结果表明ADSCs主要通过旁分泌的途径,促进血管形成,抑制细胞凋亡,从而促进膀胱功能的修复。本项研究为ADSCs在膀胱功能修复医学中的研究与应用打下了基础。