滨蒿内酯作为传统中药的有效单体,系从菊科植物茵陈蒿或滨蒿的花蕾及未成熟的种子中分离,又名6,7-二甲氧基-2-氢-苯并吡喃-2-酮、蒿属香豆精、东喘宁,早期主要在复方中用于保肝利胆,后经研究人员发现其具有广泛的药理作用,如保护心脑血管、抑制肿瘤、抗肾衰、细胞保护等。本教研室在植物药滨蒿的前期研究中发现:主要成分滨蒿内酯具有舒张豚鼠气管平滑肌的作用,课题组还进行了一系列在治疗哮喘及其机制方面的研究,结果显示:滨蒿内酯具有平喘、松弛气道平滑肌、降低气管平滑肌内钙、清除气道氧自由基、抑制气道炎症等作用。为了进一步明确滨蒿内酯的作用机理,本实验在前期研究工作的基础上,从滨蒿内酯对肥大细胞脱颗粒的影响入手,探讨其抗过敏的作用以及对钙离子信号变化的影响,为过敏性疾病的临床治疗提供理论依据。　　 实验方法:　　 豚鼠腹腔肥大细胞的分离和纯化将健康豚鼠击头处死,浸入75％乙醇中消毒,消毒后固定于超净台内消毒木板上,剔除胸腹部毛,用75％酒精棉球消毒腹部皮肤。腹腔注射预冷的RPMI1640培养液15ml,轻轻按摩腹部2-3min,小心打开腹腔,吸取腹腔冲洗液置于干净的离心管中,用吸管吹打混匀。4℃,1500rpm,离心5min弃上清,将细胞悬液缓慢加入等体积比的30％:80％的Percoll梯度分离液中,4℃,2500rpm,离心15min,收集交界处的细胞,置于干净的离心管中,吸管吹打混匀。PBS工作液洗两次4℃,1500rpm,离心10min。镜下计数,调整细胞浓度至1×105个细胞/ml。胎盘蓝染色,活力大于95％。甲苯胺蓝染色,纯度大于90％,置于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中悬浮备用。　　 体外致敏的肥大细胞模型将肥大细胞悬液与含1gE血清按1:1的比例混合,然后置入37℃,5％CO2孵箱中孵育2h,每管约含肥大细胞1×105个,用含1％FBS的PBS轻轻洗涤2次,去除未结合的血清。用PBS重悬后,滨蒿内酯组肥大细胞分别加入1×10-5mol·L-1、1×10-6mol·L-1、1×10-7mol·L-1滨蒿内酯在培养箱中孵育10min,10min后加入OVA(0.2 mg·ml-1)反应8min,然后置于冰浴中5min以终止反应。致敏组在培养箱中孵10min后立即加入OVA(0.2mg·ml-1)反应8min,然后置于冰浴中5min终止反应。空白组以生理盐水代替药物。将各组试管4℃,2000rpm,10min离心,镜下观察,取视野下细胞相对密集区域分别测定各组100个肥大细胞中脱颗粒程度,每组10次。　　 组胺的测定分别取各组细胞,加入HC1O4(终浓度0.4mol/L),离心(4℃,4000rpm,10min),取上清。取上清液1.6ml,置于已加1.5g的NaCl的10ml带塞试管中,加4.0ml正丁醇和0.2ml NaOH(2.5mol/L),立即混匀,置振荡器中震荡5min。然后取出3.6ml正丁醇相加到已加1.2ml HC1(0.1mol/L)和2ml正庚烷的带塞试管中。震荡5min,弃去有机相,取1ml HC1相置入10ml带塞试管中。加入1mL NaOH(0.4mol·L-1),然后立即加入0.1％邻苯二甲醛0.2mL,振荡混匀,37℃孵育10min,加入1.0ml,0.5mol·-1的HC1终止反应。对应的细胞用PBS重悬后经细胞破碎仪彻底破碎,其他处理方式同上清处理。荧光分光光度计比色,检测组胺含量,激发波长330nm,发射波长440nm。根据制定的组胺标准曲线分别计算细胞上清中组胺含量和细胞中组胺含量,组胺释放率=上清组胺/(上清组胺+胞内组胺)×100％。　　 类胰蛋白酶活力的测定方法酶活力的测定采用专用底物BAPNA(α-N-苯甲酰-D L-精氨酸-P-硝基苯胺)。BAPNA以20mg/ml溶于二甲基亚砜,混匀后取40μl加入含待测液的0.1mol·L-1反应缓冲液1.5ml中,反应缓冲液为Tris-HC1(PH7.4),30℃反应20 min后,加入0.5ml30％(v/v)乙酸终止反应,在405nm测光吸收值。以反应缓冲液做参比调零。　　 细胞内[Ca2+]的测定将1mmol/L Fluo-3/AM按1:200体积比用无钙液稀释为终浓度为5μmol/L,将悬浮培养的肥大细胞加入已预先覆盖多聚赖氨酸的六孔板中负载。在37℃、通气(95％O2和5％CO2)的条件下避光负载45min,而后用PBS冲洗两次,稳定15min,以确保Fluo-3/AM细胞内溶解为Fluo-3,再用倒置荧光显微镜观察细胞图像,激发波长488nm,发射波长528nm。图像分辨率为640×480像素,每侦采集时间为1s。在应用Metafluo分析软件进行图像处理时,采用套锁的方式选取细胞,对单个细胞进行分析。钙离子浓度的变化用△F/F0的比值来表示,F0为基础荧光密度值,F为给予不同工具药后细胞的荧光密度值,△F/F0=(F-F0)/F0代表给药后钙离子的变化程度。　　 统计学处理所有数据均以x-±s表示,应用SPSS16.0软件进行单因数方差分析和t检验,显著性标准用P＜0.05表示。　　 结果:　　 1、在肥大细胞体外致敏的情况下,致敏组肥大细胞脱颗粒明显高于正常组(P＜0.05)。滨蒿内酯组(1×10-5mol·L-1,1×10-6mol·L-1)作用于豚鼠腹腔肥大细胞,与致敏组肥大细胞相比较脱颗粒现象得到了有效的改善(P＜0.05),但1×10-7mol·L-1滨蒿内酯组与致敏组相比无明显差异(P＞0.05)。　　 2、在肥大细胞体外致敏的情况下,致敏组肥大细胞释放的组胺和类胰蛋白酶明显高于正常组(P＜0.05)。滨蒿内酯组(1×10-5mol·L-1、、1×10-6mol·-1)与致敏组比较,组胺释放率和类胰蛋白酶活力降低(P＜0.05),但1×10-7mol·L-1滨蒿内酯组与致敏组相比无明显差异(P＞0.05)。　　 3、在正常肥大细胞中,不同浓度的滨蒿内酯(1×10-5mol·L-1、1×10-6mol·L-1、1×10-7mol·L-1)对肥大细胞[Ca2+]I具有不同程度的抑制作用并呈剂量依赖性。　　 4、在致敏肥大细胞中,不同浓度的滨蒿内酯(1×10-5mol·L-1、1×10-6mol·L-1、×10-7mol·L-1)对肥大细胞[Ca2+]I具有不同程度的抑制作用并呈剂量依赖性,其中1×10-5mol·L-1滨蒿内酯组抑制作用最明显。与正常组相比较,滨蒿内酯对致敏组肥大细胞的[Ca2+]I抑制作用更为显著。　　 结论:　　 1、滨蒿内酯对体外致敏的肥大细胞脱颗粒具有一定的抑制作用,其作用机制可能与抑制炎症作用有关。　　 2、滨蒿内酯对体外致敏的肥大细胞释放组胺和类胰蛋白酶具有一定的抑制作用,其可能通过抑制肥大细胞脱颗粒而影响组胺和类胰蛋白酶的释放。　　 3、滨蒿内酯能够抑制豚鼠正常肥大细胞以及致敏肥大细胞[Ca2+]I释放并呈剂量依赖性,提示滨蒿内酯影响肥大细胞[Ca2+]I的改变与过敏疾病的治疗有重要的关联。