论文部分内容阅读
近年来,血红素加氧酶(heme oxygenase,HO)及其产物一氧化碳(carbon monoxide,CO)的生理作用得到了越来越广泛的关注。动物中的研究表明,HO/CO信号系统在细胞对抗氧化伤害的过程中扮演了重要的生理角色。越来越多的实验结果证明,HO/CO信号系统在植物体内也具有类似的生理效应。在本论文中,我们首先采用不同浓度的聚乙二醇PEG-6000(12.5%、25%和50%)预处理小麦种子1天,发现低浓度12.5% PEG可以促进小麦种子的萌发,25% PEG处理明显降低了其萌发率,高浓度50% PEG胁迫后的小麦种子则基本不萌发。在恢复过程中,25% PEG预处理后的小麦种子可以较快恢复至正常萌发水平,50% PEG胁迫后的则不能完全恢复。同时观察了恢复过程中小麦种子内膜脂过氧化产物硫代巴比妥酸活性反应物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)的含量、HO活性以及HO-1基因表达量的变化。下述结果表明12.5%和25% PEG均可以显著诱导其内源HO活性以及HO-1转录本的提高,但12.5% PEG预处理可诱导恢复过程中小麦种子内TBARS含量的下降,25%PEG预处理则不能；50% PEG胁迫不仅诱导了小麦种子内膜脂过氧化水平的提高同时对HO活性以及HO-1基因表达均产生明显抑制效应。因此,我们进一步采用HO-1的诱导剂Hematin处理25%PEG胁迫的小麦种子,发现Hematin以浓度依赖的方式诱导了25%PEG胁迫下小麦种子的萌发及根的伸长,其中1.0μmo1·L-1 Hematin处理效果最为明显,它不仅可以诱导其内源HO活性的增加,并且呈现出时间进程的方式。同时发现上述Hematin对种子萌发抑制的缓解效应可能是通过提高淀粉酶活性来加速储藏物质的降解和诱导各种抗氧化酶活性上升来降低25% PEG胁迫所造成的氧化损伤的。半定量RT-PCR也得到相同的结果,小麦种子中过氧化氢酶(catalase,CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxifdase,APX).锰-超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase,Mn-SOD)和铜,锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-superoxide dismutas,Cu,Zn-SOD)(?)勺转录水平均有所提高。为了验证HO的催化产物CO是否参与了小麦种子对渗透胁迫的响应过程,我们同时采用不同稀释度的CO气体饱和溶液处理25% PEG胁迫的小麦种子,发现其具有与上述Hematin类似的缓解效应。并且通过测定不同处理后小麦种子中CO的含量,发现Hematin处理不仅可以显著诱导25% PEG胁迫下小麦种子中CO的释放,且CO含量的变化与上述HO活性的变化趋势一致。加入HO-1的抑制剂锌原卟啉(ZnPPIX)则逆转了上述诱导效应,初步证明CO也参与调控渗透胁迫下小麦种子的萌发,内源HO/CO信号系统在小麦种子对渗透胁迫的响应过程中具有十分重要的生理作用。我们进一步研究发现上述Hematin的生理效应可能与种子内源NO的释放相关。Hematin处理可诱导渗透胁迫早期小麦种子内NO的释放。加入NO的专一性清除剂2-(4-羧基苯)-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)逆转了上述Hematin对种子萌发抑制的缓解效应。综上所述,NO可能参与了HO/CO信号系统对渗透胁迫下小麦种子萌发的调控过程。小麦幼苗在黑暗条件下生长会出现黄化现象。已有文献报道,NO可以提高黄化小麦幼苗叶片叶绿素的含量。我们的研究发现在光照恢复过程中,内源HO活性、HO-1基因表达以及CO释放量均显著提高,加入HO-1的抑制剂ZnPPIX,明显逆转上述光的诱导效应,表明内源HO/CO信号系统参与了光诱导的小麦幼苗的脱黄化过程。同时发现,在不存在光的条件下,Hematin以及CO气体饱和溶液均可以以浓度依赖的方式缓解黄化小麦幼苗叶片叶绿素的降解。其中,10.0μmol·L-1 Hematin和1.0% CO气体饱和溶液的处理效果最为明显。此外,与仅经过暗诱导黄化的小麦幼苗相比,Hematin和CO气体饱和溶液处理不仅显著提高其内源HO的活性、光敏色素的总量同时诱导了HO-1基因以及PhyA、PhyB和PhyC前体蛋白基因的表达。硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)处理也具有相同的作用效果。加入动物中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和NO的专一性清除剂2-(4-羧基苯)-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)明显阻断了上述SNP、Hematin以及CO气体饱和溶液的生理效应。同时发现Hematin和CO气体饱和溶液可以显著提高黄化小麦幼苗内NO的释放量,暗示NO可能参与上述HO/CO信号系统调控的小麦幼苗脱黄化过程。基于上述实验结果,我们推测：外源HO-1的诱导剂Hematin以及CO气体饱和溶液可能是通过调动内源HO/CO信号系统来进行信号的级联放大或者外源CO气体本身就可以作为信号分子通过与内源NO互作来调控小麦幼苗脱黄化这一生理过程且与光敏色素密切相关。为了进一步了解该基因的生理功能,我们以拟南芥HO-1基因序列为模板进行BLAST得到一系列具有同源性的小麦EST序列,利用生物信息学软件进行拼接得到小麦HO-1基因序列。利用RT-PCR的方法克隆得到其全长cDNA。聚类分析表明,小麦HO-1基因与其他植物内该基因高度同源。对小麦幼苗分别进行(?)NaCl、PEG-6000以及H2O2处理,采用半定量RT-PCR方法对小麦HO-1基因的表达模式进行检测,发现NaCl处理在短期内就可诱导小麦HO-1基因的表达。