消旋-3-正丁基苯酞对溴化乙锭诱导脱髓鞘模型作用及其机制研究

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gsdx2009
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多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是中枢神经系统的一种自身免疫性炎症脱髓鞘性疾病,其特征在于少突胶质细胞(Oligodendrocyte,OLs)丧失,脱髓鞘,炎症和神经元变性。临床上具有病灶的空间多发性和时间的多发性。具有全世界广泛分布的特点。可导致严重的身体或认知障碍以及神经缺陷。该病病程反复,致残率高,加重家庭与社会负担。但是目前MS的病因和发病机制尚不清楚。目前认为是由遗传易感性、病毒感染、环境因素影响、自身免疫反应异常和氧化应激反应等多种因素综合作用的结果。OLs是唯一髓鞘形成细胞。目前认为,髓鞘是由OLs膜形成的扁平突起包裹形成,OLs的数量与功能对髓鞘的完整性具有不可替代的作用。保护OLs在中枢神经系统(central nervous system,CNS)免受损伤,为MS的治疗提供了新的思路。线粒体是细胞能量加工厂,线粒体能将细胞中的有机物当燃料,使这些有机物与氧结合,经过复杂的过程,转变为二氧化碳和水,同时将有机物中的化学能释放出来,供细胞利用。线粒体损伤导致细胞能量代谢障碍,导致细胞能量衰竭。如线粒体功能障碍有助于自由基的形成。由于来自电子传递链的电子泄漏,线粒体是活性氧(reactive oxygen species,ROS)的恒定来源。同时,当线粒体因伤害性因素激活线粒体介导的内源性凋亡途径,导致细胞凋亡。消旋-3-正丁基苯酞(dl-3-n-Butylphthalide,NBP)是从芹菜中提取的消旋体,是我国具有自主知识产权的新药,主要用于脑梗死患者。研究发现,NBP能够稳定线粒体结构稳定,保护线粒体功能,改善脑组织血流、抗凝、保护血脑屏障等作用,在脑梗死患者治疗过程中,取得良好的收益。溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)是一种能够内嵌式DNA染料,将EB注射至脑组织可见注射区域局限性白质脱髓鞘。能够定向诱导特定部位脱髓鞘。在中枢神经系统脱髓鞘模型中被广泛应用。目的本研究旨通过定向注射EB至右侧脑室,诱导脑室周围白质脱髓鞘,构建EB模型。用NBP作为干预药物,探索在探讨NBP对EB模型的作用及其机制。方法将36只健康SD大鼠随机平均分为3组:EB组(12只)、NBP组(12只)、假手术组(12只)。其中EB组和NBP组通过右侧脑室注射EB诱导建立中枢神经系统(CNS)脱髓鞘模型。假手术组通过右侧脑室注射生理盐水作为对照。NBP组中的大鼠以腹腔注射的方式给予剂量为20 mg/(kg·d)NBP干预,EB组和假手术组以相同的方式注射相同量的生理盐水。14天后,采用LFB染色检测各组大鼠脱髓鞘程度;采用HE染色检测各组大鼠白质组织炎性细胞浸润;采用Tunel法检测各组大鼠少突胶质细胞凋亡情况;采用免疫组织化学染色方法检测MBP、caspase 9的表达;采用western blot方法检测MBP、Cyt C的表达。结果造模14天后,LFB髓鞘染色观察发现与假手术组相比,EB组可见脑室周围白质严重髓鞘脱失,大片的空泡变性脱失区域。与EB组相比,NBP组脑白质周围组织髓鞘较完整,脱髓鞘减轻。EB组、NBP组、假手术组的脱髓鞘评分分别为2.5±0.522、1.333±0.492、0.167±0.389。EB组脑白质周围组织脱髓鞘评分明显高于假手术组(P<0.05),NBP组脑白质周围组织脱髓鞘评分明显低于EB组(P<0.05)。证实定向侧脑室注射成功诱导CNS脱髓鞘。HE染色可见EB组脑室周围白质组织松散,炎性细胞浸润,与EB组相比,NBP组可见脑白质周围组织炎性细胞减少,组织相对致密。Tunel染色可见,EB组脑室周围白质弥漫性分布凋亡细胞,NBP组可见部分凋亡细胞存在,假手术组较少见凋亡细胞。EB组、NBP组、假手术组凋亡细胞占比分别为0.397±0.015、0.188±0.019、0.164±0.012。与假手术组相比,EB组脑白质周围组织存在大量OLs凋亡(P<0.05),与EB组相比,NBP组脑白质周围组织OLs凋亡减少(P<0.05)。MBP免疫组织化学染色显示:EB组MBP表达减少,可见大片空泡区域。与EB组相比,NBP组MBP表达增加,但可见部分斑块状脱失。EB组、NBP组、假手术组MBP平均光密度分别是0.204±0.014、0.368±0.021、0.392±0.030。与假手术组相比,EB组MBP表达减少(P<0.05),与EB组相比,NBP组MBP表达增加但仍可见部分斑块状MBP脱失(P<0.05)。caspase 9免疫组织化学染色显示:EB组脑室周围白质caspase 9广泛表达,与EB组相比NBP组caspase 9表达减少。EB组、NBP组、假手术组caspase 9平均光密度分别为0.221±0.030、0.129±0.034、0.104±0.021。与假手术组相比,EB组caspase 9表达减增多(P<0.05),与EB组相比,NBP组caspase 9表达减少(P<0.05)。Western blot检测MBP表达,EB组、NBP组、假手术组MBP灰度值分别为0.600±0.190、1.076±0.162、1.083±0.188。与假手术组相比,EB组MBP表达减少(P<0.05),与EB组相比,NBP组MBP表达增加(P<0.05)。Western blot检测Cyt C表达,EB组、NBP组、假手术组MBP灰度值分别为1.203±0.243、0.835±0.138、1.076±0.162。与假手术组相比,Cyt C表达减增多(P<0.05),与EB组相比,NBP组Cyt C表达增减少(P<0.05)。结论NBP对EB诱导的CNS脱髓鞘具有保护作用。保护机制与抑制OLs内线粒体介导的内源性凋亡有关。
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