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β-半乳糖苷酶可以分解乳糖,用于牛奶的处理,解决乳糖不耐症;也可生产低聚半乳糖,用于功能食品、食品添加剂等。耐热酶不仅大大降低了微生物污染的风险,更重要的是在高温下仍有较高催化活性,具有较高的初始反应速率和底物溶解浓度。对于工业应用而言,良好的耐热性是酶的一个重要特性。目前关于耐热性强且催化活性高的乳糖酶研究较少。本研究以来源于凝结芽孢杆菌T-242的乳糖酶氨基酸序列为基础,通过计算机模拟为其理性改造提供理论依据。首先,应用 ProtParam、ProtScale、SignalP、TMHMM、SOPMA 等生物信息学服务器,对来源于耐热芽孢杆菌T-242的耐热β-半乳糖苷酶进行生物信息学分析;通过BLAST程序搜索评分高的三条链为模板。通过CLUSTALX将酶氨基酸链与模板链进行序列比对,并提交至SWISS-MODEL耐热B-半乳糖苷酶在线服务器,用同源建模法对酶的结构进行预测,并对同源建模结果进行质量检验。结果表明:此耐热β-半乳糖苷酶由665个氨基酸残基构成,分子量为76.09kDa,其分子式为C3451H5221N907O988S27,该酶的原子总数为10594,理论等电点6.06;无跨膜区域及信号肽;二级结构以α-螺旋结构及无规则卷曲结构为主要组成部分;三维结构为同源三聚体,且以3TTS为模板同源建模结果质量最好,且有较高的可信度,可作为酶分子改造的结构基础。并通过Pymol比对找到T-242耐热β-半乳糖苷酶活性位点的区域范围,为下一步的分子对接模拟提供基础。最后通过SDS-PAGE电泳实验证明其单链分子量为78kDa,与服务器预测值相近,通过Native-PAGE电泳估测乳糖酶保持其酶活时的分子量,并以此验证此乳糖酶为同源三聚体。然后,通过AutoDock软件进行T-242 β-半乳糖苷酶与底物ONPG的分子对接模拟,根据对接结果,找出距活性口袋5A范围内的所有氨基酸,除去保守性氨基酸后,将亲水性氨基酸突变为疏水性氨基酸,以扩大活性口袋,提高酶的亲和力。将Gln 314分别突变为Gly、Cys、Ser,分别命名为突变酶Lac1、突变酶Lac 2、突变酶Lac 3。结果表明:三个突变酶的亲和力均增强,其中以突变酶Lac 3最优,结合能从-5.49kJ降低到-6.76kJ。最后,通过GROM ACS 4.5进行分子动力学模拟,模拟温度为350K(77 ℃)。将RMSF值较高的氨基酸突变为Pro,通过RMSD值和回旋半径值分析突变前后的热稳定性。将3位Lys突变为Pro,命名为突变酶Lac a;将3位Lys、101位Asp、6位Glu都突变为Pro命名为突变酶Lac b,再分别进行动力学模拟。结果表明:两个突变酶的热稳定性均有提高,其中以突变酶Lacb更优,RMSD值由0.267nm降低到0.221nm;回旋半径值由3.85nm降低到3.0nm。