宫颈癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤,发病率仅次于乳腺癌,居女性恶性肿瘤第二位。全世界每年约有50万新增病例,其中超过1/3发生于中国。目前研究表明高危型人乳头瘤病毒的感染是宫颈癌发病最主要的因素,但是HPV病毒感染到发展为宫颈癌被认为是涉及多基因、多阶段的共同结果,具体的分子机制目前尚未完全明了。目前宫颈癌的主要治疗方式包括手术、化疗和放疗,随着手术技能的提高及新兴化疗药物的研发,提高了早期宫颈癌患者的治愈率,但晚期、复发患者生存率仍维持在较低水平。因此,寻找与宫颈癌发生发展相关的分子靶点,提高患者生存率是我们亟待解决的问题。人滋养层细胞表面抗原-2(human trophoblast cell-surface antigens 2, TROP2)隶属于肿瘤相关钙信号转导蛋白TACSTD (tumor-associated calcium signal transducer)家族,由323个氨基酸组成的一种单层跨膜表面糖蛋白,参与调控细胞内的钙离子浓度。从结构上来讲,其胞质尾区包括一个PIP2(磷脂酰肌醇二磷酸)的结合域及酪氨酸和丝氨酸磷酸化位点,为TROP2参与恶性肿瘤细胞信号通路的转导提供可能的靶点。目前研究证实TROP2在多种恶性肿瘤中高表达,在正常组织中低表达,并且与肿瘤的不良预后密切相关。TROP2被认为通过调控ERK/MAPK信号通路,参与细胞周期相关蛋白的激活从而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭等恶性生物学行为。基于TROP2在肿瘤细胞中所表现出的特性,被认为是潜在的早期肿瘤预测因子和肿瘤靶向治疗的新目标。肿瘤热疗是指用加热的方法来消除肿瘤细胞的一类治疗方法,温度维持在42.5℃-43.5℃,持续60min～120min,既可达到杀伤肿瘤细胞而不损伤正常组织的目的(正常组织细胞的温度安全界限为45℃±1℃),热疗是继手术、化疗、放疗和免疫疗法之后的第五大疗法。随着纳米科技的发展,以纳米材料为基础的激光辅助热疗越来越受到研究者的青睐。当激光照射到金属纳米表面的自由电子可引发共振,导致自由电子吸收光热量,且比常规的光敏材料吸收能力大4-5倍,在原子与自由电子相互作用下,这种能量可以在极短的时间内从电子传递给纳米金颗粒,这种强吸收的能量使得激光束以强大的侵袭力准确地定位到治疗靶点从而达到预期目的。我们利用TROP2在宫颈癌细胞表面高表达,在正常组织中低表达的特点,研制合成的新型的纳米材料-空心纳米金球(Hollow Gold Nanosphere, HGNs),在此基础上靶向偶联anti-TROP2单克隆抗体,形成复合纳米颗粒,体外实验研究靶向纳米金颗粒联合光热治疗对宫颈癌细胞的杀伤作用,进一步探究纳米金近红外光热疗的作用机理,以望对今后宫颈癌临床肿瘤治疗提供新的理论依据和技术支持。第一部分TROP2在宫颈癌中的表达及与Ki-67的相关性研究目的：检测并分析TROP2在宫颈病变组织中的表达,探讨TROP2的表达在宫颈癌细胞增殖中的作用及与患者临床病理特征、预后的相关性。方法：采用免疫组织化学方法检测20例正常宫颈组织、34例宫颈上皮内瘤变(CIN)、106例宫颈癌中TROP2及Ki-67蛋白的表达；卡方检验分析TROP2表达水平与临床病理特征的相关性；Spearman检验法分析TROP2和Ki-67表达的相关性；单因素和多因素Cox回归分析宫颈癌患者预后的影响因素；Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线；Log-rank检验分析比较患者的总体生存率和无进展生存率的差别。结果：1.TROP2主要表达于病变宫颈组织的细胞膜。在正常宫颈组织中,8例(40%)呈弱阳性表达,1例(5%)中等阳性,无强阳性表达。TROP2在CIN组中的表达率呈现递增趋势,其中CINⅠ阳性率为50%,CINⅡ阳性率为66.7%,CINⅢ阳性率为76.9%,且差异有统计学意义(p=0.037)。宫颈癌组织中TROP2表达率最高,为88.7%,明显高于CIN和正常宫颈组织,三者比较,差异存在统计学意义(p<0.001)。2. TROP2的表达与宫颈癌组织学分化程度、FIGOI临床分期、浸润深度及淋巴结转移关系密切,而与宫颈癌患者年龄(p=0.1)及肿瘤直径(P=0.255)无明显相关性。3.Ki-67在正常宫颈组织、CIN、宫颈癌中的表达阳性率逐渐升高,阳性率依次为25%(5/20),55.9%(19/34),79.2%(84/106),三组差异有统计学意义(p<0.001)。相关性Spearman相关分析显示,TROP2和Ki-67在宫颈癌组织中的表达具有显著相关性(r=0.440,p<0.001)。4. TROP2高表达病人与低表达病人相比,表现出更低的OS和PFS。应用多因素Cox回归分析,结果显示,TROP2蛋白表达水平、组织学分级及淋巴结转移是影响宫颈癌预后的独立因素。结论：1.TROP2在正常宫颈组织、CIN组织、宫颈癌组织中表达量逐渐升高,且TROP2的高表达与宫颈癌的不良临床病理特征相关,说明TROP2参与了宫颈癌的发生发展过程。2.TROP2与Ki-67的表达呈正相关,说明TROP2可能参与了宫颈癌细胞的生长及增殖过程。3.TROP2的高表达影响宫颈癌患者的预后,是评价宫颈癌预后的独立因素。第二部分TROP2的表达对宫颈癌生物学行为的影响及相关机制研究目的：探讨TROP2的表达对宫颈癌细胞生长增殖、凋亡、周期、侵袭转移及化疗耐药等能力的影响,探讨TROP2在宫颈癌发病中的作用机制。方法：通过siRNA干扰沉默宫颈癌Siha和CaSki细胞中TROP2的表达,pcDNA3.1 TROP2质粒转染过表达HeLa和C33A细胞中TROP2的表达。Western blot技术检测并确认干扰效率之后,CCK8法检测TROP2表达水平的改变对宫颈癌细胞增殖能力的影响；AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡；流式细胞仪检测细胞周期；细胞划痕实验及Transwell小室测定细胞迁移及侵袭能力；Western blot检测凋亡、周期、侵袭相关蛋白表达的变化及与ERK/MAPK信号通路的相关性；应用不同浓度的顺铂作用于TROP2基因沉默后的Siha和CaSki细胞,CCK-8法绘制细胞生存曲线,比较IC50,并分析化疗耐药与TROP2的表达及ERK1/2信号通路的相关性。结果：1. Western blot检测TROP2在Siha, HeLa, CaSki和C33A细胞中均有表达,设计并合成的siRNA-1100和siRNA-550序列均能有效地减少TROP2的表达,干扰效率在70%以上；真核表达质粒pcDNA3.1 TROP2转染之后,TROP2蛋白表达量明显升高,确定瞬时转染成功。2.CCK-8法研究发现,TROP2基因沉默的Siha和CaSki细胞增殖能力明细下降(p<0.05),而过表达TROP2的HeLa和C33A细胞在转染后2-4天增殖能力明显增加(p<0.05)。3. AnnexinV-FITC/PI双染法通过流式细胞仪检测细胞凋亡,发现TROP2基因表达沉默之后,Siha和CaSki细胞早期和晚期凋亡率明显升高,总凋亡率也显著提高(p<0.05)。相反,HeLa和C33A细胞在TROP2表达上调之后早期凋亡、晚期凋亡率及总凋亡率均明显下降(p<0.05)。TROP2基因沉默后的Siha和CaSki细胞Bcl-2表达显著降低,而Bax表达量上升。而TROP2过表达的HeLa和C33A细胞,Bcl-2表达上调而Bax表达下调。4.通过流式细胞仪检测细胞周期,发现TROP2基因沉默后48h,Siha和CaSki细胞G1期细胞明显增多,而S期显著减少(p<0.05)。TROP2表达上升之后,HeLa和C33A细胞G1期明显减少,而S期细胞增多,差异有统计学意义(p<0.05)。TROP2的表达下调,导致细胞周期素D1 (cyclin D1),细胞周期素E(cyclin E),细胞周期素依赖激酶2(CDK2, Cyclin Dependent Kinase 2)和细胞周期素依赖激酶4(CDK4, Cyclin Dependent Kinase 4)表达显著降低,而细胞周期素依赖激酶抑制子p27表达显著升高；而TROP2的表达上调之后,表现出了相反的结果,cyclinD, cyclinE, CDK2以及CDK4的表达升高,而p27表达下降。5.细胞划痕试验证实,在TROP2基因沉默后,细胞的迁移能力明显下降。而获得性高表达TROP2之后,细胞的迁移能力明显升高。通过Transwell小室实验发现,TROP2表达下降后,细胞侵袭能力降低,而过表达TROP2后细胞侵袭能力增强(p<0.05)。Siha和CaSki在TROP2基因沉默后48h,E-cadherin的表达量明显上调；而HeLa和C33A细胞在获得性高表达TROP2之后,E-cadherin的表达量下降。6. TROP2基因的沉默抑制了p-ERK1/2的表达,但不影响Total-ERK1/2的表达。而HeLa和C33A细胞在获得性高表达TROP2之后,p-ERK1/2的表达量升高。提示TROP2与ERK信号通路存在关联。7.CCK-8结果显示,TROP2蛋白表达水平降低后细胞在顺铂作用下的存活率较对照组细胞明显降低,IC50明显低于对照组细胞。Hoechst33258荧光检测表明,TROP2基因的沉默导致细胞凋亡的数目明显增多。Western blot结果显示,Siha细胞在30μM顺铂处理48h后,ERK的磷酸化下降,TROP2基因沉默后,ERK的磷酸化下降更为明显。利用30 u M顺铂处理Siha细胞24h,在10μM ERK抑制剂U0126作用影响下,可明显降低siRNA干扰组细胞的活性(p<0.05)。结论：1.TROP2参与了宫颈癌细胞增殖、凋亡、周期、迁移和侵袭等恶性生物学行为,干扰其表达提高了对顺铂的敏感性。说明TROP2在宫颈癌的发生发展中有着重要的作用,并对宫颈癌靶向治疗提供理论依据。2. TROP2在宫颈癌细胞中与ERK/MAPK信号通路存在关联,影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、化疗耐药等恶性生物学行为。的磷酸化下降更为明显。利用30 u M顺铂处理Siha细胞24h,在10μM ERK抑制剂U0126作用影响下,可明显降低siRNA干扰组细胞的活性(p<0.05)。结论：1.TROP2参与了宫颈癌细胞增殖、凋亡、周期、迁移和侵袭等恶性生物学行为,干扰其表达提高了对顺铂的敏感性。说明TROP2在宫颈癌的发生发展中有着重要的作用,并对宫颈癌靶向治疗提供理论依据。2. TROP2在宫颈癌细胞中与ERK/MAPK信号通路存在关联,影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、化疗耐药等恶性生物学行为。第三部分Anti-TROP2/空心纳米金球近红外热疗对宫颈癌细胞作用的实验研究目的：研制合成具有肿瘤细胞靶向作用的空心纳米金颗粒,评价HGNs及anti-TROP2/HGNs近红外热疗对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制及杀伤作用,进一步揭示纳米材料联合近红外热疗对肿瘤细胞的作用机制。方法：采用湿化学法,首先制备合成纳米银粒子,然后以此为模板,加入氯金酸还原得到HGNs。用异官能团的聚已二醇SH-PEG-COOH作为连接剂将HGNs与anti-TROP2抗体共价键偶联,HGNs与mPEG-SH孵育形成mPEG/HGNs作为对照。通过透射电镜,紫外分光光度计等对合成的纳米粒子进行表征。通过CCK-8的方法检测HGNs对宫颈癌HeLa细胞的毒性。倒置显微镜及TEM观察纳米金粒子在HeLa细胞内的分布及摄取情况。CCK-8方法检测在不同功率的近红外激光照射下,mPEG/HGNs及anti-TROP2/HGNs对HeLa细胞生长抑制的程度。光镜下观察HeLa细胞经过光热治疗后的形态变化。流式细胞仪检测细胞凋亡率。Hoechst进行凋亡染色分析。Western blot方法检测光热治疗后bcl-2和bax的表达变化。共聚焦显微镜观察γ-H2AX的表达变化。结果：1.合成的HGNs形态规则,呈中空的圆球形,大小均一,分散良好,均匀分布。HGNs的粒径为51.6±7 nm,厚度为4.67±1.52 nm,紫外吸收光谱可见在780nm处有明显的等离子共振吸收峰。利用异官能团的聚已二醇SH-PEG-COOH将HGNs与anti-TROP2抗体共价键连接,TEM照片显示,偶联上抗体的HGNs仍保持中空的圆球形形态,分布均匀,分散性良好,未见颗粒间明显团聚粘连。疏水粒径较HGNs有所增加,紫外吸收光谱可见最大吸收峰位置红移,从780nm移动到818 nn左右。2.将浓度为0.3nM, 1nM,2nM和3nM的HGNs作用于宫颈癌HeLa细胞3-48h,CCK8结果显示HGNs未表现出明显的毒性。3.倒置显微镜下观察HGNs与HeLa细胞共培养1小时后即能进入细胞,投射电镜下观察到明显的膜样结构的吞噬泡形成。4. HeLa细胞与mPEG/HGNs及anti-TROP2/HGNs分别孵育6h,12h,24h及48h后,用ICP-MS法分别检测细胞内摄取纳米金粒子的个数。在前12h,HeLa细胞吸收mPEG/HGNs及anti-TROP2/HGNs数目均较少,在24h,吸收纳米金颗粒达到高峰,且吸收anti-TROP2/HGNs数目明显多于mPEG/HGNs,差异有统计学意义。5.分别将2nM mPEG/HGNs和anti-TROP2/HGNs与HeLa细胞共同孵育培养3h,再经不同功率(2.5,5,10,15W/cm2)红外激光(808nm)照射5min。CCK-8检测细胞活力发现anti-TROP2/HGNs联合光热治疗后,HeLa细胞活性明显降低,较mPEG/HGNs及单纯照射组差异明显,有统计学意义。经过PI-Hoechst凋亡染色后发现,而anti-TROP2/HGNs加热疗组大量细胞皱缩呈亮蓝色,可见核分叶,碎片状,边集,而PI着色的坏死细胞也明显增多。单纯照射组细胞活力无明显改变。6. AnnexinV-FITC和PI双染法,利用细胞流式技术检测细胞凋亡,发现anti-TROP2/HGNs联合光热治疗后,细胞凋亡的数目较单纯照射组明显增加,并伴有细胞的坏死。Bcl-2的表达量较单纯照射组降低,而Bax蛋白表达量上升。7.共聚焦显微镜观察Y-H2AX的表达变化,anti-TROP2/HGNs联合光热治疗组细胞γ-H2AX的聚点的数目较单纯照射组明显增强。提示近红外光热治疗导致DNA双链的断裂。结论：1.本实验成功制备了空心纳米金球,共价键连接anti-TROP2抗体,细胞摄取anti-TROP2/HGNs明显多于摄取mPEG/HGNs。2.低浓度的HGNs对HeLa细胞无明显毒性。3. anti-TROP2/HGNs近红外热疗对HeLa细胞有杀伤作用,较mPEG/HGNs杀伤能力更强。4. anti-TROP2/HGNs近红外热疗杀伤HeLa细胞的机制可能是通过调节凋亡因子Bcl-2和bax介导的线粒体途径及诱导DNA双链的断裂。