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目的:克隆致倦库蚊Cecropin基因家族的4个基因;比较分析Cecropin家族基因的结构、氨基酸序列、蛋白理化特性,预测蛋白空间结构,以及其进化关系;了解Cecropin家族基因在致倦库蚊不同发育时期的表达谱;选择Cec B2进行原核表达,检测Cec B2多肽的抑菌活性。方法:通过生物信息学方法从致倦库蚊基因组和转录组中筛选出致倦库蚊Cecropin基因家族的4个基因,并进行序列分析和系统发育分析;采用RT-PCR方法从致倦库蚊c DNA中扩增出Cecropin家族4个基因,与p MD-18T载体连接后测序鉴定;提取致倦库蚊不同发育时期的总RNA,通过半定量PCR检测4个Cecropin基因在不同龄期的表达;构建Cec B2重组表达质粒,鉴定正确后转入Rosetta表达菌中,优化IPTG诱导浓度和诱导时间,表达纯化重组蛋白,并采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行检测和鉴定,进一步透析、浓缩及肠激酶切割纯化的融合蛋白,采用Tricine-SDS-PAGE检测Cec B2目的蛋白。同时通过化学合成方法合成足量Cec B2成熟肽,并进行体外抑菌活性检测。结果:1.致倦库蚊Cecropin基因家族的编码氨基酸平均长度约60aa,编码蛋白的平均理论分子量和平均等电点p I值分别为6389.0和10.69,为小分子碱性蛋白;系统进化分析表明致倦库蚊Cecropin与冈比亚按蚊和埃及伊蚊亲缘关系较近。2.半定量PCR研究发现,Cec B2在整个发育时期均有表达,而Cec B1,Cec A1,Cec A2除卵期无明显表达外其余时期均有不同程度表达,总的表达趋势为随虫龄的增长而增加。3.成功构建原核表达载体p ET32a-Cec B2,最佳表达条件为:0.05mmol/L IPTG诱导3h,表达纯化获得大小约25k D的融合蛋白,Western blot鉴定融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应,证明成功获得Cec B2融合蛋白,但本研究获得融合蛋白不具有抑菌活性。4.化学合成Cec B2多肽分别对G+菌(金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、溶壁微球菌),G-菌(大肠埃希菌)以及真菌(白色念珠菌)均表现出不同程度的抑菌活性,细菌最大抑菌圈达到17mm(溶壁微球菌),真菌抑菌圈达到8mm(白色念珠菌)。结论:1.致倦库蚊Cecropin为小分子碱性蛋白。2.Cec B2在整个发育时期均有表达,Cec B1,Cec A1,Cec A2除卵期无明显表达外其余时期均有不同程度表达。3.成功构建p ET32a-Cec B2原核表达载体,获取了大小约25k D的可溶性融合蛋白。4.Cec B2合成多肽对G+菌,G-菌以及真菌(白色念珠菌)具有不同程度抑菌作用,推测其具有潜在的抗生素研发意义。