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隆线溞(Daphnia carinata)是一种重要的淡水枝角类浮游动物,其富含蛋白质、维生素和钙质,是虾、蟹、鱼等经济物种的理想水产活体饵料。隆线溞生殖模式特殊,有孤雌生殖(单性生殖)和有性生殖(两性生殖)两种。外界条件适宜时,枝角类行孤雌生殖为主,孤雌溞所产的卵子无需经过受精,便可以直接发育,是大量繁殖的主要方式。当受到温度剧变、种群拥挤、食物缺乏等环境因素的胁迫时,枝角类会产生两性雌溞和雄溞,转而进行有性生殖,并形成以卵鞍包裹的休眠卵(受精卵),以此度过不良的环境。关于温度、食物、光照等环境因子对枝角类生长、发育和繁殖等方面影响的研究,已经有许多报道。但是针对枝角类生殖模式的转变,从分子生物学等微观角度进行探讨,目前相关的报道极少。Doublesex基因是一种重要的性别调节因子,最初在果蝇中发现。在果蝇性别决定的三级级联通路中,Doublesex位于Sex-lethal (Sxl)和Transformer (Tra)之后。Doublesex基因对任何一种性别表型的产生都是必需的,并且它的突变能够改变预期的性别表型,例如使XX胚胎发育成雄性个体或者使XY胚胎发育成雌性个体。在家蚕和果蝇中均发现,依据前体mRNA的不同阶段,Doublesex通过雌性特异性剪切,会产生差异性表达,分别转录为性别特异的同工mRNA。本文利用同源序列设计引物,克隆得到2条隆线溞Doublesex基因的cDNA全长序列,并命名为DapcaDsxl (GenBank登录号：KF753235)和DapcaDsx2 (GenBank登录号：KF753236)。DapcaDsxl基因cDNA全长为1618 bp, ORF框为1218bp,编码405个氨基酸。通过对比分析显示,氨基酸序列与大型溞、蚤状溞、盔形溞的同源性最高,亲缘关系最近,聚为一支,与其他物种在分子进化距离上相对较远。DapcaDsx2基因全cDNA全长为1108bp,ORF框为849bp,编码282个氨基酸。通过氨基酸序列的同源性分析可得,DapcaDsx2氨基酸序列与大型溞、蚤状溞、盔形溞的同源性最高；通过构建系统进化树可得,隆线溞与同为枝角目的物种亲缘关系比较近,最后归为一支。实时荧光定量PCR结果显示,Doublesex基因在不同时期溞体中的表达量不同,且具有显著性差异(P<0.05)。DapcaDsxl基因在早期两性溞中表达量最高,其次是两性溞、孤雌成溞和休眠卵,在孤雌幼溞中表达量最低。DapcaDsx2在早期两性溞和后期两性溞表达量最高,其次是孤雌成溞和孤雌幼溞,休眠卵的表达量最低。这说明,DapcaDsxl和DapcaDsx2的表达量在无性繁殖和有性繁殖中具有显著性差异,在不同的生殖阶段具有特异性表达,可能在生殖转化中起到重要作用。利用整体原位杂交技术,对DapcaDsxl和DapcaDsx2基因在隆线溞中的表达模式进行了初步研究。结果可知,DapcaDsxl基因主要集中在胸肢、第二触角和部分腹部外壳中表达,在两性溞中的表达部位要比孤雌溞多。而DapcaDsx2基因的表达主要集中在第二触角,在壳瓣边缘也有几处表达,同时该基因在两性溞中的表达量也要大于孤雌溞。DapcaDsxl和DapcaDsx2在隆线溞不同生殖状态中的表达差异,以及在重要的器官第二触角以及壳瓣中也可见其表达,说明这两个基因在隆线溞的生长和发育过程中可能起到调控作用。利用RNA干涉(RNA interference, RNAi)技术,对DapcaDsxl在隆线溞中的分子机理和功能进行初步探讨。结果显示,通过构建RNAi载体,喂食含有双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)菌液的方法进行RNA干涉,可以取得较好的效果。RNAi表型的隆线溞,第一触角缩短,DapcaDsxl表达量下降,碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活性下降。这说明,DapcaDsxl影响隆线溞的外形、酶活、代谢等指标,对其生长和发育可能发挥着重要作用。