【摘 要】
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脯氨酸内肽酶(Prolyl endopeptidase,PEP,[EC 3.4.21.26]),也称脯氨酰寡肽酶(Prolyl oligopeptidase,POP),是丝氨酸蛋白酶家族中的一类水解酶。该酶在脯氨酸残基羧基端水解小肽(<33个氨基酸)。本研究以来源于皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肌肉的重组PEP(Hdh-PEP)为研究对象,对Hdh-PEP的酶学性质
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脯氨酸内肽酶(Prolyl endopeptidase,PEP,[EC 3.4.21.26]),也称脯氨酰寡肽酶(Prolyl oligopeptidase,POP),是丝氨酸蛋白酶家族中的一类水解酶。该酶在脯氨酸残基羧基端水解小肽(<33个氨基酸)。本研究以来源于皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肌肉的重组PEP(Hdh-PEP)为研究对象,对Hdh-PEP的酶学性质、结构特征以及功能进行了相关研究。荧光定量PCR分析表明Hdh-PEP在鲍鱼各组织中均有分布,且在性腺、肌肉及血液中表达量较高。以Suc-Gly-Pro-MCA为底物,检测鲍鱼不同组织中Hdh-PEP的酶活,发现在性腺中酶活力最高。通过培养表达菌株获取较高浓度的重组Hdh-PEP,并检测其比活力为6.52 U/mg。圆二色光谱分析显示,Hdh-PEP二级结构无规卷曲(47.3%)占比最多,β-折叠和α-螺旋分别占比31.6%和21.1%。蛋白晶体结构显示,Hdh-PEP由催化结构域和β-螺旋桨结构域两部分组成,两个区域一侧通过铰链连接,二者因氢键、盐桥以及疏水作用力而靠近,呈闭合式构象。Hdh-PEP与特异性抑制剂SUAM-14746的共结晶结构显示,SUAM-14746通过与Hdh-PEP的639Arg和594Trp形成两个氢键实现与酶的活性中心的结合。在Hdh-PEP晶体结构的基础上结合分子动力学对酶和底物的动态结合路径进行分析以探究酶的底物通道。通过Caver Analyst软件对底物通道进行分析。结果显示,Hdh-PEP结构中存在两个最有可能的底物通道,一个位于β-螺旋桨中心(Channel-1),其通道长度为39.43?,入口半径为1.09?。另一个位于两个区域之间的Loop A(193-209)(Channel-2),它的通道长度为28.35?,入口半径为1.74?。MD模拟结果表明,当SUAM-14746靠近Hdh-PEP时,引起了Loop A(193-209)的构象由紧密到松散的构象转变。因此,推测Loop A(193-209)是底物通道门控机制的重要组成部分。利用胰蛋白酶水解实验进一步验证了Loop A(193-209)驱动门控机制的假设。为了研究Hdh-PEP对胶原蛋白的作用,采用高效液相色谱和电喷雾电离质谱联用的方法(HPLC-ESI-MS)分析了Hdh-PEP对三种不同长度的胶原蛋白小肽的降解情况。结果显示Hdh-PEP对这三个胶原蛋白小肽均能进行高效的降解,说明该酶参与鲍鱼胶原蛋白的新陈代谢。综上,本研究分析了Hdh-PEP在鲍鱼各组织中的分布和分子水平表达情况,发现Hdh-PEP分布广泛,且在性腺中有最高表达和酶活;完成了Hdh-PEP的晶体培养和结构解析,获得了Hdh-PEP的结构特征;通过对Hdh-PEP-抑制剂复合物晶体结构的分析,阐明了特异性抑制剂SUAM-14746对Hdh-PEP的抑制机理;对Hdh-PEP的底物通道进行研究,并结合分子动力学分析了小分子物质进入Hdh-PEP催化活性区域的入口和路径;Hdh-PEP对胶原蛋白小肽的降解作用,表明Hdh-PEP参与鲍鱼胶原蛋白的新陈代谢。这些结果为研究Hdh-PEP的催化机理和功能特性提供实验依据和理论参考。
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