骨缺损是指因外伤、肿瘤、疾病等因素导致的骨结构完整性破坏,是临床工作中一个常见难题,极大地影响到患者的美观和身心健康。目前临床对骨缺损的治疗主要采用骨替代物植入的方法,即在骨缺损部位植入自体骨、异体骨、异种骨来修复骨缺损。但由于这些方法均存在一定不足,如:自体骨移植来源有限,可能出现术中失血和术后疼痛等问题;异体骨、异种骨移植存在传播疾病的风险和免疫排斥的可能。随着临床对骨替代材料要求的不断提高,研制具有良好生物相容性、生物降解性、骨传导性的人工合成骨缺损修复材料已成为治疗骨缺损领域的研究热点。羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）因与天然骨组织无机结构相似,具有良好的生物相容性、骨引导性,使其成为临床工作中应用最为广泛的人工合成骨缺损修复材料。然而纯羟基磷灰石材料具有难降解、骨整合速率低、力学强度差等缺点,在一定范围内制约了其临床应用。研究发现天然骨组织无机成分中的HA,并非完全按照标准化学计量学以Ca₁₀（PO4）₆（OH）₂的形式存在,而是被不同离子（镁、钠、钾、锶、硅、氟、碳）置换取代。天然骨的无机成分中含有镁、钠、钾、锶、硅、氟、碳等多种不同的微量元素,缺乏这些微量元素可增加骨折的风险。目前在羟基磷灰石基础上添加一种或某几种元素改性羟基磷灰石的方法得到较为广泛的研究,但国内外对于多元掺杂仿生羟基磷灰石的研究仍处于空白。中科院上海硅酸盐研究所依据人体骨微量元素的含量,将Na、K、Mg、Al、Zn、Sr、Si、F和C等多种元素按照人体骨骼成分掺入羟基磷灰石晶格内部,制备出仿人体骨成分的多元掺杂纳米羟基磷灰石材料。研究目的:本实验以水热法制备出非掺杂纳米羟基磷灰石（HA₁）为参照,对比研究相同条件下制备出的新型仿生多元掺杂纳米羟基磷灰石（HA₂）对成骨前体细胞分化及成骨作用的影响。研究方法:实验第一部分:水热法制备多元掺杂羟基磷灰石粉体及非掺杂羟基磷灰石粉体,电镜观察两者颗粒大小及形态。实验第二部分:制备不同浓度的多元掺杂羟基磷灰石粉体悬液并测定其在不同浓度条件下其对成骨前体细胞的影响。实验第三部分:分四组进行:对照组（细胞培养液）;矿化组（矿化诱导液）;矿化+HA₁（含0.05mg/ml HA₁的矿化诱导液）;矿化+HA₂（含0.05mg/ml HA₂的矿化诱导液）,对比在矿化诱导液作用下非掺杂纳米羟基磷灰石与多元掺杂纳米羟基磷灰石对成骨前体细胞成骨作用的影响。实验第四部分:分四组进行:对照组（细胞培养液）;矿化组（矿化诱导液）;HA₁（含0.05mg/ml HA₁的细胞培养液）;HA₂（含0.05mg/ml HA₂的细胞培养液）,对比去除矿化诱导液作用后,两种不同粉体材料是否也对成骨前体细胞具有矿化成骨的作用。研究结果:1、通过电镜扫描观察单纯纳米羟基磷灰石（HA₁）和多元掺杂纳米羟基磷灰石（HA₂）具有等级结构,掺杂并没有改变羟基磷灰石形颗粒大小及形貌。2、（1）当多元掺杂羟基磷灰石粉体（HA₂）浓度在0-0.05mg/ml范围内可促进成骨前体细胞（MC3T3-E1）增殖,当HA₂浓度高于0.05 mg/ml,HA₂会抑制成骨前体细胞增长。（2）进一步通过Hochest33342/PI双染发现,当培养基内HA₂的浓度为0.5mg/ml和0.125mg/ml时会造成一定程度的细胞凋亡,且凋亡染色的强度与粉体浓度及处理时间呈正比。当粉体浓度降至0.05mg/ml时处理组凋亡现象不明显。3、（1）通过碱性磷酸酶活性染色观察发现:矿化、矿化+HA₁、矿化+HA₂均可使成骨前体细胞的ALP活性增强,对照组成骨前体细胞也具有少量的ALP活性,但其染色强度明显不及其他三组。矿化+HA₁组、矿化+HA₂组均比矿化组更易促进细胞ALP活性。其中,矿化+HA₂组比矿化+HA₁组更有益于成骨前体细胞ALP活性表达。（2）通过半定量PCR测量发现:与对照组相比,矿化组、矿化+HA₁组和矿化+HA₂组均可促进成骨相关基因ALP、OCN、OPN的高表达,在矿化诱导液基础上加入了HA₁、HA₂的两组比单纯矿化组对三组基因变化的影响作用强,且在矿化诱导液作用下加入HA₂刺激作用明显强于HA₁。其中,ALP基因水平组间差异在处理后的第3天开始体现（p<0.005）,矿化+HA₂组对ALP基因水平的促进作用明显高于矿化+HA₁组。随着培养时间延长,组间差异不断增大（p<0.0001）。ALP水平在矿化诱导第10天达到高峰,在第14天下降。其中,OCN的基因水平在处理的早期阶段并未出现明显差异,从第5天起各组间才开始逐渐产生差异（p<0.05）,矿化+HA₂组对OCN基因水平的促进作用高于矿化+HA₁组且随着培养时间的延长,两组间差异不断增加。其中,OPN基因水平在处理的第3天开始产生组间差异,其中矿化+HA₁组和矿化+HA₂组的OPN基因的水平明显高于矿化组和对照组,但矿化+HA₁组和矿化+HA₂组的组间差异从第5天才开始体现（p<0.05）,且矿化+HA₂组更易于促进OPN的基因表达。（3）茜素红染色发现:除对照组外所有处理组在15天均可以看到一些矿化小颗粒形成,继续培养至第21天可见典型矿化结节产生,红染的块状结节代表矿化成骨的效果。研究发现MC3T3-E1作为成骨前体细胞不能自行发生矿化成骨作用,但矿化组、矿化+HA₁组、矿化+HA₂组均可以使其产生矿化结节。矿化结节的多少及染色强度关系为:矿化+HA₂组>矿化+HA₁组>矿化诱导组。4、当去除矿化诱导液的作用后,通过观察对照组、矿化组、HA₁组、HA₂组的碱性磷酸酶染色、成骨基因半定量PCR测量及茜素红染色发现:单纯的HA₁、HA₂粉体对成骨前体细胞同样具有矿化诱导及促进分化的作用,且HA₂的矿化诱导作用比HA₁作用更强。结论:1、中科院硅酸盐研究所根据人体骨骼中各微量元素的含量配比制备出多元掺杂纳米羟基磷灰石,观察发现掺杂多种元素并未引起羟基磷灰石尺寸及大小的明显变化,所制备的材料的颗粒尺寸与同样方法制备出的非掺杂纳米羟基磷灰石颗粒相似。2、在本实验条件下最适于研究仿生多元掺杂羟基磷灰石粉体对成骨前体细胞生物学作用的溶液浓度为0.05mg/ml。3、对照组不能使成骨前体细胞产生矿化作用,另外三组可以使其产生矿化作用,其中矿化+HA₁、矿化+HA₂组比矿化组对成骨前体细胞矿化作用更强,矿化+HA₂组比矿化+HA₁组对成骨前体细胞的促进作用更强。4、当矿化+HA₁组、矿化+HA₂组去矿化诱导液后,单纯含HA₁、HA₂粉体的成骨培养液仍可以促进成骨前体细胞分化成骨,且两种粉体的促进作用均强于矿化组,其中HA₂组对成骨前体细胞的矿化成骨作用强于HA₁组。本研究揭示了多元掺杂纳米羟基磷灰石材料具有良好的生物相容性及促进成骨分化的性能,是一种具有广阔应用前景的硬组织植入材料。