论文部分内容阅读
过氧化氢酶是一种催化效率非常高的生化酶，在纺织、造纸、食品、医药、临床等行业有着广泛的用途。来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(株)的过氧化氢酶具有优良的热稳定性，但该菌株产过氧化氢酶水平很低。随着基因工程技术的快速发展，现在越来越多的外源蛋白都实现了在大肠杆菌宿主中的高水平表达外源重组蛋白在大肠杆菌中往往以胞内产物的形式存在，很难分泌到胞外，目的蛋白的分离首先需要对菌体进行破碎。将噬菌体溶菌酶基因克隆到宿主菌中，构建可控裂解的基因工程菌是一种温和、可控、操作简单的方法。
通过PCR方法扩增得到嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)IAM11001(ATCC8005)过氧化氢酶的结构基因perA，与带强启动子λPRPL的温度控制表达载体pBV220连接后成功构建得到重组质粒pBV-perA。将pBV-perA转化到E.coliJM109中实现了过氧化氢酶基因的高表达。在LB培养基和半合成培养基中考察了诱导时机和诱导时间对重组E.coliJM109(pBV-perA)产酶的影响。在LB培养基中当诱导时机和诱导时间都为5h，产酶量最大，达到72.9U/mL；在半合成培养基中当葡萄糖浓度为10g/L，诱导时机为4h，诱导时间为6h时，产酶最高，酶活达到131U/mL。
通过PCR方法定点诱变并扩增得到温度敏感的T4噬菌体溶菌酶基因ets，与表达载体pUC19连接后转化E.coliJM109，得到重组菌株E.coliJM109(pUC19-ets)。重组菌在三角瓶中通过添加IPTG诱导后，悬浮于裂解缓冲液bufferTE中，菌体在10min内吸光度由1.75迅速下降到0.25左右，成功实现了可控裂解。将带有SD序列的T4噬菌体溶菌酶基因ets插入pBV-perA质粒perA基因下游上，重组质粒pBV220-perA-ets转化E.coliJM109，得到可控裂解的产过氧化氢酶基因工程菌。该重组菌在升温诱导条件下，实现了过氧化氢酶基因和溶菌酶基因的共表达，发酵后成功实现了细胞的可控裂解。裂解液中蛋白浓度为总蛋白浓度的96.13％，过氧化氢酶活力为总酶活力的62.1％。裂解液在发酵罐上500r/mm搅拌6min，粘度由2000mpa.s降低到70mpa.s左右。