目的：恶性肿瘤所致的死亡率中,白血病在男性中居第六位,女性中居第八位,儿童及35岁以下成人中则居第一位。白血病的治疗目前包括放、化疗药物降低瘤负荷获得缓解;移植和免疫治疗。　　CTL(Cytotoxic T cell,CTL)细胞目前在临床上主要应用于外周血干细胞移植和其他过继免疫治疗。根据来源移植分为自体移植和同型异体移植。自体外周血干细胞移植没有GVHD,移植后生活质量较高,但因无GVLE(graft-versus gost effect,GVLE),易复发。自体外周血干细胞移植主要靠自身CTL细胞杀灭肿瘤细胞。如果在移植后辅助性输注一定量的自身体外诱导的白血病抗原特异性的CTL细胞,复发问题可能会在一定程度上得以解决。自体移植的基础上输入一定量的供者来源的白血病细胞特异性的CTL细胞,增加GVLE,在某种程度上改变自体移植的效果。异基因造血干细胞移植(Allogeneic stem cell transplantion,Allo-SCT),由于GVLE,使得一些患者能够长期生存,然而伴随而来的移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD)、严重感染,植入失败,造血重建延迟等相关并发症成为移植成功的巨大障碍。CTL细胞是GVHD及GVL的效应细胞,也是预防移植后感染、促进植入和造血重建的重要免疫细胞。　　供者淋巴细胞输注(Donor lymphocyte transfusions,DLT)能诱导GVL效应消除白血病复发。CTL细胞是它的主要效应细胞。DLI在受者体内也会产生多种移植相关并发症,如何得到最佳疗效,使DLI得到更好的应用,是现在临床面临的一大课题。　　ALL细胞表面缺乏淋巴细胞功能性抗原(LFA-1),ALL对NK的治疗效果差,CTL细胞似乎成了除了药物唯一能针对ALL肿瘤的效应细胞了。Tc细胞在免疫治疗思想及技术路线上已经展示出了它的重要性。　　临床上发现,植入是否成功以及GVHD的严重程度与移植后供、受体T细胞比例显著相关。异基因干细胞移植即便是完全供者型,也并没有彻底去除受者的效应细胞及记忆细胞,找出针对自身肿瘤细胞的受者的CTL克隆,发挥RVLE(Recepient-versus leukemi effect,RVTE),在排斥及RVLE之间找到最佳平衡点,不仅能发挥自身识别肿瘤的免疫清除功能,而且协同供者成分发挥杀瘤效应,同时有助于了解代替免疫与过继免疫的理念,分析临床上见到的个别患者移植失败后并无疾病复发,获得长期生存,而一些患者完全供者嵌合状态下原疾病复发的原因。　　Wilms tumor antigen-1(WT1)过度表达在70％-90%的ALL病人中,而这样的病人有着高的复发率[2]。体外及小鼠研究中的证实,WT1是一个有意义且广泛表达的白血病抗原靶标。髓性白血病和健康供者中有WT1特异性的T细胞,说明WT1的表达很容易诱导出T细胞反应[3]。WT1特异性的CD8+的T细胞和白血病肿瘤负荷减轻密切相关[4]。　　高度纯化CD8+T细胞混合骨髓移植会产生高GVL效应低的致死性GVHD已得到证实[5]。如果能够培养分离出高度选择性杀伤白血病细胞的CTL克隆,对正常细胞无明显作用,无GVHD,无排斥,宿主完全耐受,扩增率高并能在体内增殖,具有强大的细胞毒性及白血病细胞清除能力,分离GVHD与GVL即将成为可能。如何在体外得到高度纯化的抗原特异性CTL细胞?就是本实验的主要目标:拟在体外分离培养CD8+WT1特异性的CTL细胞克隆,并从多方位鉴定其功能特性及其来源,为进一步的研究及应用打下基础。　　方法：　　一、体外DC培养　　树突状细胞(dendritic cell;DC)主要的功能就是特异性抗原提呈。成熟DC加工处理抗原肽-MHC-1复合物,并提呈给T细胞。DC传统培养方法大致需要4-10天,前几天为诱导分化期,最后一天为诱导成熟期。与体外CTL培养不能同步,DC成熟所需时间太长。我们改进了DC培养为2天诱导成熟法。与传统培养法及7天培养法方法比较:(1)利用四色流式细胞技术进行表型分析。(2)利用倒置显微镜及瑞-吉染色行形态观察。(3)通过HLA-A*0201同型的Tc细胞对WT1/HLA-A*0201阳性肿瘤细胞NB4的杀伤率来评价DC的提呈功能。　　二、健康供者CTL细胞单个克隆培养　　(1)免疫磁珠分选CD56-CD8+细胞:HLA-A*0201健康供者外周血单个核细胞(PBMC)行免疫磁珠去CD56+的细胞(NK)细胞,再行CD8阳选,体外PHA/WTI肽间段刺激下体外扩增。　　(2)流式细胞分选:流式细胞分选仪以CD19-细胞群中设门,WT1/HLA-A*0201/Pentamer及CD8双阳性的细胞为目的CTL细胞,收集。　　(3)饲养细胞的制备:三人份非HLA-A*0201阳性的健康供者外周血单个核细胞进行γ-射线50Gy照射,制备成饲养细胞。　　(4)CTL细胞克隆制备:所分选的目的细胞利用有限稀释法制备克隆,按比例与抗原负载的DC及饲养细胞混合后体外扩增培养。　　(5)CTL克隆细胞表型鉴定:流式检测CD45RA/CD45RO、CCR7、CD3、CD8、CD28、CD27、CD107a分子的表达率。　　(6)CTL克隆胞内分子检测:流式检测胞浆毒性颗粒GranzymeB、Perforin的阳性率。　　(7)分泌功能检测:CBA法检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-ɑ、IFN-γ、IL-17在CTL细胞培养上清的浓度。　　(8)细胞毒性的检测:克隆细胞对标准瘤株及白血病原始瘤苗杀伤率来鉴定其细胞毒功能。　　三、白血病移植后患者外周血来源的CTL细胞单克隆培养　　(1)体外刺激扩增:加用刺激因子与WT1肽进行体外特异性Tc细胞诱导扩增。　　(2)扩增后的Tc细胞流式分选:CD3+CD19-细胞群设门,WT1/HLA-A*0201/Pentamer及CD8双阳性的细胞分选后收集(CTL细胞)。　　(3)三人份非HLA-A*0201阳性的健康供者外周血单个核细胞进行γ-射线50Gy照射,制备成饲养细胞。　　(4)有限稀释法制备克隆细胞,按比例混合抗原负载的DC及饲养细胞体外扩增培养。　　(5)流式检测克隆表型分子CD45RA/CD45RO、CCR7、CD3、CD8、CD28、CD27、CD107a的表达率。　　(6)CTL克隆细胞胞浆毒性颗粒GranzymeB、Perforin的阳性率检测。　　(7)CBA法检测克隆细胞分泌的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-ɑ、IFN-γ、IL-17的浓度。　　(8)克隆细胞对标准瘤株及白血病原始瘤苗杀伤率的检测来鉴定其功能(CFSE/PI双标法)。　　四、健康人与白血病患者体外培养CTL克隆的比较研究　　利用上述方法体外平行培养两类不同来源的CTL克隆,进行表型、毒性颗粒、分泌及杀伤功能鉴定。　　五、CTL克隆细胞来源与功能的镜下研究　　(一)性别染色体原位杂交(FISH)区别CTL克隆的来源　　选用10例供受者性别差异的白血病移植后患者体外CTL克隆细胞进行性别探针杂交,荧光显微镜下观察杂交信号,根据x,y染色体的不同信号来鉴定克隆来源。　　(二)激光共聚焦扫描镜下观察CTL细胞形态与功能　　选取受者为HLA-A*0201阳性、供者非HLA-A*0201阳性的白血病HLA半相合移植后患者体外培养WT1特异性CTL克隆细胞,WT1/HLA-A*0201/Pentamer-PE标记CTL细胞,PKH26标记DC细胞,CFSE标记靶细胞NB4(WT1及HLA-A*0201双阳性的人急性早幼粒细胞白血病瘤株),共同孵育2h,镜下观察形态与功能。　　(三)扫描电镜观察克隆细胞细微结构与功能　　白血病移植后患者WT1阳性的CTL克隆细胞体外培养4-6周后,收集细胞并依此与DC及NB4细胞以一定比例混合培养2h后,收集处理细胞,镜下观察克隆细胞的功能。　　六、健康供者与白血病患者CTL克隆细胞蛋白表达差异　　分别选取三份健康人及白血病患者移植后体外扩增培养6周后的CTL克隆细胞,收集细胞裂解、提取蛋白、测浓度、双项电泳、染色、扫锚、图像分析。建立蛋白差异谱,确定差异蛋白,酶切,质谱分析。健康人外周淋巴细胞及白血病移植后外周血未培养的淋巴细胞做为基础蛋白差异谱对照,生物信息检索分析找出反应蛋白。　　结果：　　一、体外树突状细胞培养　　1、3种方法培养的DC未成熟及成熟期在形态上无差别;　　2、3种培养法DC表型差异:未成熟DC3种培养法的表型差异:传统培养法CD1a,CD86(P<0.01),CD83,HLA-DR(P<0.05)的表达均明显高于2天法;传统培养法CD1a(P<0.01)的阳性率明显高于7天法;7天培养法CD83,HLA-DR(P<0.05)的表达明显高于2天法;7d的CD83(P<0.05)明显高于传统法;成熟DC表型差异:2天与7天培养法无差异;2天培养法CD1a,CD11c,CD80,HLA-DR的表达明显高于传统培养法(P<0.05);7天培养法CD80,CD83的表达明显高于传统培养法(P<0.05);　　3、3种培养法成熟DC的抗原活性:2天及7天培养法对靶细胞的杀伤率(75.8±7.1)%,(74.6±3.2)%明显高于传统法(65.2±1.3)%(P<0.01)。　　二、健康供者CTL克隆细胞培养与鉴定　　1、表型:CD3+CD8+的细胞占(98.7±0.2),CD27占(62.3±10.0)%,CD28占(71.9±7.9)%;CD107a占(49.0±11.0)%,CD45RA占(65.1±8.4)%,CD45RO占(34.3±4.2)%,CCR7(18.1±5.2)%。　　2、胞内毒性颗粒表达率:颗粒酶B:(43.9±7.4)%,穿孔素(32.7±6.8)%。　　3、克隆亚群比例:CD45RA+CD27+CCR7+占(9.0±2.0)%;CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7+占(13.0±2.4)%;CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7-占(26.1±5.9)%;CD45RA+CD27+/-CD28+/-占(61.3±7.9)%。　　4、五聚体检测:WT1/HLA-A*0201五聚体及CD8双阳性率在(76±3.9)%。　　5、分泌功能:IL-2(2129.5±414.7)%、IL-4(17.5±9.1)%、IL-6(21.6±9.7)%、IL-10(24.8±8.6)、TNF-ɑ(40.8±21.5)%、IFN-γ(102.3±61.0)%、IL-17(18.5±8.6)%。　　6、对NB4的杀伤率(89.7±7.6)%明显高于对U937和K562杀伤率(19.0±4.3)%,(19.7±5.2)%,P<0.05。对白血病原始瘤苗AML和ALL的杀伤率(54.0±16.6)%,(56.5±12.4)%无差别,P>0.05。　　三、白血病NASCT患者CTL克隆细胞的培养与鉴定　　1、表型:CD3+CD8+的细胞占(98.6±0.5),CD27占(66.3±8.1)%,CD28占(70.1±7.8)%;CD107a占(51.4±7.7)%,CD45RA占(65.7±6.3)%,CD45RO占(33.9.1±4.5)%,CCR7(17.1±2.7)%。　　2、胞内毒性颗粒表达率:颗粒酶B:(40.6±9)%,穿孔素(30.9±6.2)%。　　3、克隆亚群比例:CD45RA+CD27+CCR7+占(12.6±3.2)%;CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7+占(17.5±4.6)%;CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7-占(19.5±3.6)%;CD45RA+CD27+/-CD28+/-占(62.1±7.4)%。　　4、五聚体检测:WT1/HLA-A*0201五聚体及CD8双阳性率在(70.2±8.5)%。　　5、分泌功能:IL-2(2365.0±246.1)%、IL-4(40.5±8.3)%、IL-6(1705.3.6±416.2)%、IL-10(63.2±22.2)、TNF-ɑ(121.3±35.3)%、IFN-γ(219.5.3±65.1)%、IL-17(14.5±5.0)%。　　6、对NB4的杀伤率(84.5±5.1)%明显高于对U937和K562杀伤率(21.5±5.5)%,(22.3±6.5)%,P<0.05。对白血病原始瘤苗AML和的杀伤率(66.4±7.6)%明显高于对ALL的杀伤率(58.6±5.6)%,P<0.05。　　四、白血病NASCT患者与健康供者CTL克隆比较　　两者表型无差异：毒性颗粒表达率无差异；患者分泌的细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ明显高于健康供者(P<0.01),IL-17无差别(P>0.05)；细胞毒功能未发现明显差别。　　五、白血病NASCT患者CTL克隆来源与功能研究　　1、FISH发现了白血病NASCT患者体外培养CTL克隆中有受体的CTL细胞。　　2、LMST发现白血病NASCT后受者的CTL细胞并直接观察到其细胞毒性。　　3、高分辨扫锚电镜下观察,发现培养的CTL克隆细胞呈典型T细胞形态,与DC细胞间有丝状物交通联络,并杀伤溶解靶细胞的功能。　　六、两类单克隆CTL细胞蛋白表达差异　　1、NASCT患者与健康供者外周血未培养的淋巴细胞蛋白差异点有30个,鉴定出13个功能明确的蛋白。　　2、白血病NASCT患者与健康供者CTL克隆细胞差异蛋白点44个,鉴定出25个功能蛋白,明显上调的18个,下调的12个,4个为未命名蛋白。　　3、白血病及移植相关的共同反应蛋白有4个,分别为Coactosin-like protein、Septin-1]、 Purine nucleoside phosphorylase, GATA3。　　结论：　　(1)2天诱导成熟的DC形态功能都达到功能DC的标准,这种培养方法是成功的。　　(2)健康人与白血病患者体外CTL单个克隆培养方法是成功的、在体外能有效扩增(单个细胞扩增到1-5×107个细胞),扩增成功率为78%。经一系列鉴定,培养的克隆细胞表型、功能均为功能性CTL细胞。　　(3)培养的CTL克隆细胞亚群包括一定比例的记忆细胞表型,说明克隆细胞是由一个细胞分化增殖形成不同阶段的细胞亚群组成。　　(4)白血病NASCT患者来源的CTL克隆分泌功能明显比健康供者的CTL克隆旺盛。　　(5)免疫磁珠分选结合五聚体流式分选可以得到高纯度的CD8+的CTL细胞,可以做为单个克隆培养的备用细胞。　　(6)HLA限制性肽特异性的五聚体与FISH相互补充,可以鉴定一部分NASCT患者CTL克隆的来源。　　(7)健康供者与白血病NASCT患者之间的PBMNC及CTL克隆在蛋白表达上存生着明显差异。