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脓毒症是宿主对感染反应失调引起危及生命的器官功能障碍,是重症监护病房患者入院和死亡的主要原因,其死亡率占住院死亡率30%～50%。脓毒症的高病死率仍是目前一个重大的医学问题。因此,探索其发生发展的机制尤为重要。迄今为止,脓毒症确切的机制尚不清楚,但学者普遍认为,免疫细胞和体细胞释放的炎性因子导致的细胞因子风暴和免疫反应失调在脓毒症的发病机制中发挥着重要作用。而最近的研究表明,炎症反应中的活性分子反应需要强有力的代谢支持,而调节代谢途径可能成为治疗炎症性疾病的新手段。二甲双胍是一种具有代谢调节活性的小分子物质,是治疗2型糖尿病的一线降糖药。除了众所周知的降糖作用外,越来越多的证据表明,二甲双胍具有抑制促炎症因子的作用,并减轻炎症动物模型的炎症损伤。然而,二甲双胍抗炎性的药理机制尚不清楚。有研究报道,二甲双胍通过抑制线粒体呼吸复合物的活性,从而减少三磷酸腺苷酶的生成,并激活细胞内单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)。一些研究进一步验证二甲双胍通过激活AMPK可改善脓毒症动物的炎症反应和器官衰竭,表明AMPK在脓毒症的发病机制中起着重要的作用。叉头框蛋白O(fork head box protein O,FOXO)蛋白家族是一大类转录因子,能直接参与基因的转录表达以及协同其他的转录因子进行转录调控,首次在果蝇体内被发现。FOXO为其家族的一个亚群,在哺乳动物中主要有四个亚型,其中FOXO1在体内各组织均有表达,在细胞凋亡、氧化应激、DNA损伤/修复、糖代谢和炎性疾病中具有重要的调节作用。目前有研究发现,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)致脓毒症小鼠模型中FOXO1低表达,肺损伤程度较显著。FOXO1作为AMPK的主要作用靶点之一,因此,有报道证明了二甲双胍可通过激活AMPK-FOXO1通路改善宫颈内膜癌预后,在脓毒症等重症疾病中,尚未有相关报道。目前,已知FOXO1可以通过调节早期炎症因子如核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等改善脓毒症的炎症反应,然而,对于脓毒症晚期致命炎症因子如高迁移率族蛋白1(high mobility group proteinl,HMGB1)是否有影响,目前尚未有报道。基于此,提出本研究的假说,二甲双胍改善脓毒症预后的机制可能是通过激活AMPK后,抑制FOXO1表达,从而抑制肝细胞HMGB1的释放。综上,本研究基于前期院前使用二甲双胍改善脓毒症患者预后的Meta分析结果,利用LPS构建脓毒症小鼠模型,验证二甲双胍是否具有改善脓毒症预后的作用。据此,拟进一步探讨二甲双胍改善脓毒症预后的潜在机制。第一部分二甲双胍改善脓毒症合并糖尿病患者预后的Meta分析方法1.数据库检索:检索MEDLINE,EMBASE和Cochrane CENTRAL数据库,检索时间从数据库建成至2018年9月30日。2.研究对象:研究类型为队列研究,选择院前使用二甲双胍脓毒症合并糖尿病成年患者为研究对象。3.纳入研究的质量评估:使用纽卡斯尔-渥太华量表(newcastle-ottawascale,NOS)评估表来评价纳入研究的偏倚风险评估。4.使用具有随机效应模型的逆方差方法来计算合并的优势比(odds ratio,OR)及其95%置信区间(confidence interval,CI)。5.用敏感性分析、漏斗图分析总合并效应量的异质性来源。结果本研究纳入了 5项队列研究,共1282例患者。根据NOS质量评估表结果示,这些研究均被判断为低偏倚风险。本Meta分析结果显示,院前使用二甲双胍能降低脓毒症合并糖尿病症成年患者的病死率(OR,0.59;95%CI,0.43-0.79,P=0.001)。小结院前使用二甲双胍能改善脓毒症合并糖尿病成年患者的病死率。第二部分 二甲双胍通过AMPK-FOXO1通路改善脓毒症相关肝损伤的机制研究方法1.构建脓毒症小鼠模型取7-8周雄性C57BL/6J小鼠,采用LPS(12.5mg/Kg)腹腔注射构建脓毒症小鼠模型,观察建模12,24和48小时后小鼠的症状和表现;并于建模后24和48小时收集各组小鼠肝组织进行H&E染色和TUNNEL试验并分析其结果,观察肝损伤程度和细胞凋亡的数量,和对照组进行比较。2.探究二甲双胍改善脓毒症小鼠预后的作用60只雄性C57BL/6J小鼠,适应性饲养一周,随机分为三组,对照组(20只),LPS组(20只),LPS+MET组(20只)。LPS组给予腹腔注射LPS 12.5mg/Kg 1小时后腹腔注射等量的生理盐水,之后每天腹腔注射一次生理盐水直至第5天;LPS+MET组小鼠给予腹腔注射LPS 12.5mg/Kg1小时后腹腔注射二甲双胍(25mg/Kg),之后每天腹腔注射二甲双胍一次直至第5天,每天观察并记录各组小鼠的状态和死亡情况。3.探究二甲双胍减轻脓毒症小鼠系统性炎症反应和肝损伤的作用(1)观察二甲双胍减轻脓毒症小鼠系统性炎症反应的情况在建模12,24和48小时后,各组小鼠均采用摘取眼球的方式进行取血,并用促凝管收集,室温静置两小时后2500rpm转速离心后取上清液,即为血清。检测各组小鼠的血清炎性指标TNF-α、HMGB1、白介素(interleukin,IL)-1β的变化情况。(2)观察二甲双胍改善脓毒症相关肝损伤和炎症的情况在建模12,24和48小时后,分别采用预冷的生理盐水经左心室进行灌注,分别取各组小鼠的肝脏,一部分用做好标记的冻存管收集并放置于液氮罐内冻存,再取完整的一个肝组织放置于装有预冷的4%多聚甲醛的离心管内进行固定。采用蛋白免疫印记试验(western blotting,WB),实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR),HE染色和TUNNEL试验检测各组小鼠的肝组织炎症指标如TNF-α,HMGB1和肝损伤程度的变化情况。4.探究二甲双胍保护脓毒症小鼠的作用及其机制研究收集各组小鼠12,24和48小时的肝组织,采用WB,RT-PCR检测各组小鼠的AMPK,p-AMPK以及FOXO1表达水平与炎症因子TNF-α和HMGB1的变化情况。结果LPS处理12,24和48小时后对各组小鼠进行观察发现,与对照组相比,LPS组小鼠的肝组织炎性渗出和细胞凋亡现象显著增加,而二甲双胍能改善这些由LPS导致的异常。且与对照组相比较,LPS组小鼠外周血清TNF-α、HMGB1、IL-1β等炎症因子水平显著升高(P均<0.05),而二甲双胍治疗后,这些炎性因子水平明显降低(P均<0.05)。肝组织WB和RT-qPCR结果均显示,LPS组FOXO1、TNF-α和HMGB1等表达均高于对照组,LPS组p-AMPK的水平则低于对照组;二甲双胍治疗可逆转LPS引起的促炎因子高表达以及p-AMPK的低表达(P均<0.05)。此外,LPS组的病死率远高于对照组,而二甲双胍处理后明显降低脓毒症小鼠的病死率(P均<0.05)。小结二甲双胍可能通过激活AMPK,抑制FOXO1表达,从而降低脓毒症小鼠炎症反应,进而改善脓毒症小鼠的病死率。结论1.院前使用二甲双胍能降低脓毒症合并糖尿病患者的病死率。2.二甲双胍可能通过激活AMPK后,抑制FOXO1表达,从而改善脓毒症小鼠肝损伤和炎症反应,进而降低脓毒症小鼠的病死率。