真核生物核糖体60S大亚基上存在着一类保守的酸性核糖体磷酸化蛋白(P蛋白),包括P0,P1和P2,它们在核糖体上共同形成一个独特的向外侧凸出的五聚体复合物茎区,此茎区与28S rRNA的一个保守结构域共同形成一个GTPase相关位点,并在蛋白质翻译延伸过程起着重要的作用。P蛋白的C-末端结构域几乎从低等生物到高等真核生物均高度保守,其保守的氨基酸序列为SDD/EDMGFGLFD。真核生物P蛋白具有一些特殊的性质。首先,P蛋白可以被CK2或者生物体内其它一些蛋白激酶磷酸化；其次,在生物体内磷酸化状态的P蛋白具有生物活性,未磷酸化的P蛋白则失去结合大亚基的功能,并从核糖体上分离出来。第三,磷酸化的P蛋白更易于结合延伸因子2(EF-2)参与蛋白质合成的延伸过程。蛋白激酶CK2,是一种高度保守的真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它是由两个催化亚基(α和α’)和两个调节亚基(β)构成的不均一四聚体。CK2的磷酸化底物具有多样性,这些底物包括许多关键酶、生长因子、转录因子和细胞骨架蛋白等。纤毛虫是一类单细胞原生动物,含有一个大核以及一个小核。大核为营养核,小核为生殖核,小核在有性生殖过程中发育为大核,通过基因的删除、断裂、扩增形成大核染色体,每个染色体为一个转录单位,由端粒(C4A4C4A4C4)、编码区以及两侧的非编码区组成。纤毛虫中存在密码子使用的特殊性,比如游仆虫,将UAA和UAG作为终止密码子,UGA编码半胱氨酸。目前研究还发现游仆虫中超过5%的基因发生了编程性翻译移码(Programmed translational frameshift),且均为+1位的移码突变。本研究以八肋游仆虫(一种淡水纤毛虫)为材料,采用PCR的方法,从基因组和cDNA中克隆了酸性核糖体磷酸化蛋白P0,P1和P2基因(命名为EoPO, EoP1和EoP2)。构建了重组质粒pRSETC-EoPO和pRSETC-EoP2,在大肠杆菌BL21中表达并利用镍柱进行了纯化。利用核磁共振、Native-PAGE以及Phos-tagTM SDS-PAGE三种方法检测EoP2的磷酸化作用。利用pull-down检测EoP2及磷酸化状态的EoP2与EoEF-2之间的相互作用。获得以下主要结果：1.八肋游仆虫EoPO、EoP1和EoP2基因的克隆。分别以八肋游仆虫基因组和cDNA为模板,PCR扩增得到EoP0和EoP2的全长以及开放阅读框基因,EoP0和EoP2的开放阅读框分别为1002 bp和336 bp；利用生物信息学软件分析以及PCR扩增得到EoPl的开放阅读框为354 bp。序列比对结果显示已获得的八肋游仆虫P蛋白基因都不具有类似其他真核生物P蛋白高度保守的C-末端序列,EoP0和EoP2比其他真核生物的C末端多出5-7个氨基酸,而EoP1比其他真核生物少5-7个氨基酸,且末端3个氨基酸为DEY。EoP1、EoP2和EoP0的氨基酸序列比对结果显示八肋游仆虫本身P蛋白的C末端也并不具有高度保守性。2.EoP0和EoP2蛋白的表达与纯化。成功构建了重组质粒pRSETC-EoPO和pRSETC-EoP2,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达,并利用镍柱和脱盐柱对EoP2纯化,获得较高纯度的EoP2蛋白。将得到的高纯度高浓度的EoP2蛋白免疫小鼠,制备了EoP2的多克隆抗体,抗体效价达到1：6000到1：12800(P/N>2.5)。3.EoP2蛋白磷酸化作用的检测。利用NetPhos 2.0软件预测EoP2蛋白磷酸化作用位点,包括Ser19(0.991)、Ser21(0.991)、Ser29(0.661)、Ser66(0.868)、Thr17(0.665), Thr41(0.958)、Tyr 112(0.960); Phos-tagTM SDS-PAGE和核磁共振结果均显示在体外EoP2可以被CK2磷酸化。我们选择预测磷酸化作用分值较高的位点Ser19(0.991)、 Ser21(0.991)、Thr41(0.958)和Tyr112(0.960)进行单点以及多点突变,并在体外表达及纯化突变体蛋白。同时在体外表达并纯化CK2催化亚基CK2α和调节亚基CK2β。核磁共振结果显示除EoP2-S21A和EoP2-S19A-S21A之外,WT-EoP2、EoP2-S19A、 EoP2-T41A和EoP2-Y112A均可被CK2磷酸化,初步认为EoP2的磷酸化作用位点位于S21位。同时,我们还利用Native-PAGE检测磷酸化作用,发现EoP2磷酸化后的蛋白比非磷酸化的蛋白具有更高的迁移率,进一步证明EoP2的磷酸化作用位点位于N-端结构域的S21位。4.EoP2和EoEF-2的相互作用位点分析。从八肋游仆虫基因组和cDNA中克隆得到EoEF-2全长和开放阅读框基因；将读框中TGA突变为大肠杆菌中编码半胱氨酸的密码子TGT并在大肠杆菌中进行了表达纯化。对EoP2和EoEF-2分别进行截短突变,共构建突变体6个,利用pull-down研究EoP2和EoEF-2的相互作用位点,结果表明二者的相互作用位点位于EoP2的C-末端结构域和EoEF-2的N-端结构域。将EoP2基因中21位丝氨酸定点突变为天冬氨酸模拟其磷酸化作用,并利用pull-down检测磷酸化蛋白与EoEF-2之间的相互作用,结果发现磷酸化后的蛋白并未明显加强两者之间的相互作用。综上所述,八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白基因(EoPO, EoP1和EoP21与NCBI中已报道的其他生物的相应序列具有同源性,但其却具有特殊的C-末端结构域；通过pull-down实验证明EoP2和EoEF-2的相互作用位点位于该特殊的C-末端结构域以及EoEF-2的N-端结构域,推测EoP2在蛋白质合成的延伸阶段可能具有重要的作用。Phos-tagTM SDS-PAGE、Native-PAGE和核磁共振结果显示EoP2可以被CK2磷酸化,但与其他生物不同的是其磷酸化位点并不位于C-末端结构域,而是位于N-端结构域的S21位,且模拟的磷酸化蛋白并未增强与EoEF-2之间的相互作用,暗示磷酸化后的P2蛋白可能在蛋白延伸过程中具有其他特殊的生物学功能。八肋游仆虫酸性核糖体蛋白的性质研究为进一步研究低等真核生物酸性核糖体蛋白在蛋白合成延伸过程中的重要性提供了数据支持。