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目的:研究两种不同饮食(非常高脂饮食和适度高脂加胆固醇饮食)对野生型和肝脏特异性FOXO1/3/4三重基因敲除小鼠代谢的影响,探讨FOXOs转录因子在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发生发展中的作用。方法:选用FOXO1/3/4 floxed小鼠(WT control)和肝脏特异性FOXO1/3/4三重基因敲除小鼠(LTKO)作为研究对象。1、应用两种不同饮食即非常高脂饮食(HFD)和适度高脂加胆固醇饮食(HFC)与常规饮食(Chow)喂养小鼠12周,获取小鼠基线和不同时期的生物学特征。2、应用TRI试剂进行肝脏RNA的提取,Invitrogen试剂盒逆转录合成cDNA,real-time PCR检测FOXO1/3/4基因;提取肝脏组织蛋白,采用Western-Blot方法检测肝脏Foxo1,Foxo3的蛋白表达以确认肝脏基因敲除情况。3、肝脏组织病理切片H&E染色和天然猩红染色显微镜下观察肝脏脂肪变和纤维化的程度,以期了解各组不同的表型特征。4、采血检测小鼠血浆各种生化指标的水平,提取肝脏脂肪检测肝脏甘油三酯含量。5、应用TRI试剂进行肝脏RNA的提取,Invitrogen试剂盒逆转录合成cDNA,real-time PCR检测跟肝脏脂肪代谢、炎症、纤维化等相关基因的表达水平。6、提取肝脏组织蛋白,采用Western-Blot方法检测肝脏组织Pdgfrb和Tgfb的蛋白表达水平探讨纤维化程度。病理切片免疫组化染色检测MPO,TIMP-1,α-SMA蛋白表达。7、采用Image-J软件定量分析H&E染色切片肝脏组织脂肪变及炎症的程度,分析免疫组化染色炎症和纤维化标志物MPO,TIMP-1和α-SMA点染密度。结果:1、肝脏FOXO1/3/4基因敲除通过real-time PCR和Western Blot确认,各饮食组LTKO小鼠FOXO1/3/4基因敲除成功,因为Foxo4蛋白在肝脏组织量很少,我们没有展示。2、不同饮食及肝脏FOXO1/3/4基因敲除对小鼠食物总能量的摄入没有明显影响,HFD饮食小鼠相比较chow和HFC小鼠体重增长更明显。基因敲除后肝脏重量明显增加,肝脏/体重比在HFC饮食组几乎高达2倍。3、在三种饮食条件下,LTKO肝脏脂滴的沉积明显增加。HFC小鼠呈现最坏的肝脏脂肪样变。天然猩红染色结果显示FOXO1/3/4基因敲除使各种饮食小鼠纤维化程度加重,与chow相比,HFD和HFC肝脏纤维化程度增加,HFC纤维化程度最重。4、各饮食组基因敲除小鼠血浆甘油三酯均明显增加,但在不同饮食之间没有明显差别。血浆胆固醇chow和HFC组LTKO小鼠较WT升高。FOXO1/3/4基因敲除后,肝脏损伤的炎症标志物ALT水平明显增加,HFD和HFC饮食加重肝脏的损伤,HFC损伤更明显。5、肝脏脂肪合成基因Srebp1在HFC饲养的小鼠肝脏明显升高,但未达到统计学意义。脂肪酸氧化基因Cpt1a在HFC饲养的小鼠肝脏表达显著下降,Acox2在HFD饲养的小鼠肝脏比Chow小鼠肝脏明显降低。WT肝脏Emr1基因的表达被HFD和HFC诱导,HFC饮食LTKO肝脏更进一步升高。与WT小鼠相比,LTKO肝脏Cc12 mRNA的水平升高,但没有达到统计学意义。纤维化相关基因Pdgfrb、Tgfb在LTKO小鼠升高,并且被HFC饮食诱导。Col1a1、Timp1被HFD和HFC饮食诱导,FOXO1/3/4基因缺乏进一步升高其表达。6、Western Blot方法Pdgfrb、Tgfb蛋白检测LTKO小鼠明显升高,并且被HFC饮食诱导。肝脏组织切片免疫组化NASH标志物MPO染色炎症细胞浸润分析和纤维化标志物α-SMA和TIMP-1分析结果表明,与WT小鼠相比,三种饮食组LTKO小鼠点染的密度更高,HFD和HFC饮食升高其表达,HFC饮食最严重。7、Image-J软件定量分析数字评分结果显示LTKO小鼠脂肪变和炎症(炎症细胞浸润和MPO免疫组化染色),纤维化(α-SMA和TIMP-1免疫组化染色)的程度升高,HFD和HFC饮食加重其病变,HFC更为严重。结论:1、跟WT小鼠相比,FOXO1/3/4肝脏三重基因敲除在HFD和HFC两种饮食均诱导严重的肝脏脂肪样变,HFC饮食导致更严重的肝脏损害和纤维化。2、在分子水平上,肝脏FOXO1/3/4基因敲除触发更显著的炎症和纤维化基因的表达,包括Emr1、Cc12、Cola1、Tgfb、Pdgfrb 和 Timp1。3、FOXO转录因子在饮食诱导的脂肪性肝病中起着重要的保护作用。