D-二聚体是交朕纤维蛋白特异的降解产物,它的生成或增高反映了血浆中凝血系统和纤溶系统的激活,是唯一反映凝血和纤溶的理想指标,在临床上已视为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物。D-二聚体的定量检测可定量反映药物的溶栓效果,及可用于诊断、筛选新形成的血栓。血浆D-二聚体抗原的测定方法主要有胶乳凝集法、酶联免疫吸附(ELISA)法、光电散射比浊法和胶体金免疫渗透法(GIA ),但是到目前为止,商品的D-二聚体检测手段都尚存在一定局限性。胶体金标记技术和免疫荧光技术是近些年来发展迅速的检测技术,具有简便、快速、灵敏度高等优点。因此,本研究拟开发用胶体金和荧光染料为标记物的D-二聚体检测试剂盒,并考察试剂盒对实际样品的检测性能。首先,选用样品纸、吸收纸、硝酸纤维素膜(NC膜)及被衬垫组装成试纸条。NC膜上分别固定D-Dimer抗体A1和兔抗鼠IgG抗体,作为检测线和控制线,浓度均为2.2 mg·mL-1。若样品中含有待测抗原则与标记物包被的抗体结合,形成抗原-标记抗体复合物,当复合物移动到检测线时,检测线上固定的D-Dimer抗体与样品中的抗原-标记抗体复合物结合,形成抗体-抗原-标记抗体交联物。其余的标记抗体继续移动到质控线与质控抗体结合。由于检测线上的小分子蛋白交联物与质控线上的抗体在硝酸纤维素膜都是固定的,结合在两处的胶体金或荧光素就会显现一定的颜色或荧光。其次,采用柠檬酸三钠法制备胶体金,根据颜色、波长扫描曲线,选择粒径为18 nm的胶体金颗粒标记抗体,即100 mL氯金酸溶液(0.01%)中需加入还原剂柠檬酸三钠(1%)的量为6 mL。通过实验,胶体金标记D-Dimer抗体的pH为7.4,每毫升最佳包被量为25.6μg。本实验测定了胶体金法与生化分析仪的比对试验,回归方程为y=-0.119+1.045c,相关系数r=0.993。用胶体金法测定了灵敏度、重复性、稳定性、生物性物质干扰等性能。结果显示,该胶体金法制备的试剂盒灵敏度高(0.473μg·mL-1),并有良好的重复性(STDEV=0.093～0.115)和抗干扰性,4℃条件下可以保存很长时间。最后,用荧光染料Cy5对DD2抗体进行包被,包被完的蛋白在PBS缓冲液(pH 7.2,10 mM)中透析24小时,以除去多余的荧光染料。荧光染料-抗体蛋白稀释至500倍时有良好的检测效果,此时可以降低背景信号,还可避免荧光猝灭的发生。本实验测定了荧光素法与生化分析仪的比对试验,回归方程为y=0.00984+0.1962c,相关系数r=0.975。用荧光素法测定了灵敏度、重复性、稳定性、生物性物质干扰等性能。结果显示,该荧光素法制备的试剂盒灵敏度高(0.278μg·mL-1),并有良好的重复性(STDEV=0.029～0.093)和抗干扰性,4℃条件下可以保存很长时间。