背景动脉粥样硬化,尤其是斑块破裂引发大部分急性冠状动脉血栓形成和血管阻塞,从而产生急性冠状动脉综合征,成为全球公共卫生及经济发展的巨大负担。巨噬细胞是动脉粥样硬化斑块的重要组成部分,巨噬细胞能吞噬沉积在血管内膜的脂质及其他坏死物质。巨噬细胞的凋亡无论是在斑块形成期还是在斑块进展期都发挥重要作用且越来越多的证据表明,斑块坏死核心的发展与斑块内巨噬细胞凋亡密切相关,故对巨噬细胞凋亡的调控对动脉粥样硬化斑块控制及治疗具有重要意义。流行病学研究表明,高同型半胱氨酸血症（HHcy,血浆总同型半胱氨酸≥15μM）是近几十年发现的动脉粥样硬化的一个独立危险因素,且与AS斑块的发生及进展具有明显的相关性。在Apo E-/-小鼠这一经典动脉粥样硬化模型动物的斑块中,Hcy促进动脉粥样硬化的进展的机制有诱导内皮功能障碍、加重炎症反应、促进平滑肌细胞的增殖、促进脂质在血管内膜的沉积,以及诱导巨噬细胞凋亡等。内质网应激在动脉粥样硬化发展的各个阶段都起着重要作用。内质网是真核细胞的一种细胞器,其具有比较复杂的膜结构,其主要功能是负责蛋白质,尤其是富含二硫键的分泌型蛋白质的成熟与折叠。当有外界因素刺激,内质网腔内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的增多,伴随着内质网腔内二硫键的异常形成,超过内质网的处理能力时,就会引起内质网应激,这是晚期病变中巨噬细胞和内皮细胞凋亡的重要驱动因素。在内质网内蛋白质的折叠受到一系列酶的调控,内质网氧化还原酶1α（ERO1α）是一种常驻内质网的的巯基氧化酶,其主要功能为催化多肽底物中二硫键的形成。相关研究表明,增加的ERO1α参与了内质网应激引起的血管内皮功能障碍和心肌病的发生及发展。ERO1α的上调会加剧内质网应激,最终导致细胞死亡。有研究表明,在胰岛素抵抗型肥胖小鼠中,ERO1α是内质网应激诱导巨噬细胞凋亡的关键。因此,我们假设ERO1α可能参与了由HHcy引起的动脉粥样硬化病变中内质网应激诱导的巨噬细胞凋亡和动脉粥样硬化斑块的进展过程。为了验证这一假说,我们使用Apo E-/-小鼠和小鼠腹腔巨噬细胞,分别在动物和细胞水平通过外源添加同型半胱氨酸（Hcy）制备HHcy模型,并用慢病毒感染动物或小鼠腹腔巨噬细胞敲除或过表达ERO1α,进而探讨ERO1α在Hcy诱导的巨噬细胞凋亡和动脉粥样硬化斑块不稳定性中的作用及可能的机制。目的1.探讨Hcy对动脉粥样硬化及斑块内巨噬细胞凋亡的作用2.探究内质网应激与巨噬细胞凋亡之间的作用及其作用机制3.探究ERO1α对巨噬细胞内质网应激性凋亡在AS中的作用及机制方法方法1.用在Apo E-/-小鼠饮用水中添加Hcy的方法制备伴HHcy的AS小鼠模型,用常规HE染色检测Hcy对Apo E-/-小鼠斑块损伤面积,坏死核心面积比的影响;用Masson染色,ORO染色联合免疫组化,评价Hcy对Apo E-/-小鼠动脉粥样斑块进展的作用,进而明确Hcy在AS斑块发生发展中的作用。2.用TUNEL染色与F4/80免疫荧光染色联合的方法,以TUNEL+F4/80+代表斑块内凋亡的巨噬细胞,评价Hcy对AS斑块内巨噬细胞凋亡的作用。用内质网应激标志物GRP78与F4/80免疫荧光双染色法,用GRP78+F4/80+面积代表斑块内发生内质网应激的巨噬细胞含量,判断Hcy对AS斑块内巨噬细胞内质网应激的影响。3.分离纯化小鼠腹腔巨噬细胞,分别用不同浓度Hcy处理腔巨噬细胞24 h,或者在相同Hcy浓度的条件下,处理细胞不同时间（12 h,24 h,48 h）,筛选Hcy促进巨噬细胞凋亡的适当浓度及时间点。用4-PBA抑制内质网应激流式细胞学检测能否逆转Hcy促巨噬细胞凋亡的作用。通过流式细胞学及蛋白免疫印迹法检测Hcy对巨噬细胞内质网应激分子通路及ERO1α表达的作用。4.用尾静脉注射携带靶向ERO1α的sh RNA慢病毒或过表达慢病毒的方法调控Apo E-/-小鼠体内ERO1α表达水平,检测在Hcy存在条件下,改变ERO1α表达水平对Apo E-/-小鼠AS斑块进展及稳定性的作用,以及斑块内巨噬细胞凋亡及内质网应激水平的影响。5.通过慢病毒转染的方法调控小鼠腹腔巨噬细胞内ERO1α表达水平,检测在Hcy刺激下,改变ERO1α表达水平对体外巨噬细胞凋亡及内质网应激相关信号通路的影响。结果1.高Hcy饮食能够升高小鼠血浆Hcy水平,且达到HHcy诊断标准。HHcy组斑块损伤面积及斑块易损指数等评价斑块进展的指标较对照组升高。2.HHcy组斑块内巨噬细胞凋亡率及内质网应激标志物阳性面积高于对照组。3.Hcy促进小鼠腹腔巨噬细胞凋亡,ERO1α及内质网应激相关分子的表达,且呈剂量及时间依赖性,筛选200μM浓度Hcy干预24 h为后续试验干预条件。4-PBA抑制内质网应激能逆转Hcy促巨噬细胞凋亡的作用。4.敲除Apo E-/-小鼠体内ERO1α,HHcy组Apo E-/-小鼠AS斑块损伤面积及易损指数降低,过表达Apo E-/-小鼠体内ERO1α上述指标升高。5.在体外水平,敲除ERO1α升高Hcy刺激的巨噬细胞内质网应激水平,过表达ERO1α时上述指标降低。敲除ERO1α降低Hcy促巨噬细胞凋亡作用,ERO1α时上述指升高。结论Hcy通过上调ERO1α的表达诱导内质网应激依赖的巨噬细胞凋亡,加速AS斑块进展。ERO1α可能是AS预防及治疗的潜在靶点。