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银屑病(psoriasis)是一种由免疫介导的多基因遗传性炎症性皮肤病，可由感染、外伤、药物等多种因素诱发，以皮肤角质形成细胞(keratinocyte cell，KC)发生过度增殖和异常分化为主要特征。深入研究银屑病发病机制，并在此基础上寻找新的银屑病治疗靶点，成为当今世界皮肤科领域研究的热点和亟待解决的难题之一。课题组首次从ceRNA角度，探究lncRNA分子在银屑病发病中可能的作用，可以帮助我们从基因层面上更深入了解银屑病的发生发展，为银屑病的靶向治疗提供新方向。 研究目的： 本课题研究从ceRNA角度，利用lncRNA和mRNA表达谱芯片技术，高通量筛选IL-22介导的KC中差异表达的lncRNA，通过生物信息学分析和分子生物学实验，研究银屑病相关lncRNA-MSX2P1(MSX2P1)和S100A7的表达情况，分析MSX2P1对角质形成细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和相关炎症因子表达的影响，阐明MSX2P1作为一种ceRNA，通过竞争性结合miR-6731-5p对S100A7的调控机制及其在银屑病中的作用。 第一部分 LncRNA差异基因筛选和验证及LncRNA-MSX2P1相关CeRNA网络图构建 研究方法： (1)以人永生化角质形成细胞(Human immortalized keratinocytes，HaCaT细胞)作为研究对象，实验组给予100 ng/ml IL-22刺激24h，对照组不给予100ng/ml IL-22刺激，分别进行2次独立实验。采用RNeasy Mini Kit提取细胞总RNA，昂飞(Affymetrix)微阵列基因芯片GeneChip Human Gene2.0 ST Array分析差异表达的lncRNA及mRNA分子;并在另外独立样本中采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法对显著差异表达的10个lncRNA进行实验验证，以GAPDH作为内参，所得数据以2-ΔΔCt表示。 (2)利用生物信息学方法比对芯片来源lncRNA序列，获取差异表达lncRNA序列，用于lncRNA-miRNA靶向位点的预测。结合RT-qPCR验证结果及相关文献，挑选了差异表达显著的MSX2P1作为研究对象，应用连续概率分布法(CUPID)进行ceRNA网络图构建及相应的靶基因预测。 研究结果： (1) LncRNA微阵列芯片结果表明，两组样本间差异表达的lncRNA一共有1438个;lncRNA表达差异倍数(Fold Change，FC)＞1.5，P＜0.05的有154个，其中上调表达的有103个（占66.9％），下调表达的有51个（占33.1％）。 (2)通过对显著差异表达的10个lncRNA行RT-qPCR验证，相比于对照组，实验组中MSX2P1、IGKV1D-27、LOC100216479、LOC100287834和IGLV2-23的表达均上调(P＜0.05，P＜0.01);LOC440895、IGKV3 D-15、LOC100505942、FLJ45340和LOC284632的表达均下调(P＜0.05，P＜0.01);表达趋势与芯片结果一致。每组进行3个生物学重复，差异均具有统计学意义。 第二部分 LncRNA-MSX2P1和S100A7在银屑病皮损及角质形成细胞中的表达 研究方法： (1)对临床收集的10例寻常型银屑病皮损标本和10例健康正常皮肤组织标本进行苏木素-伊红(H&E)染色和免疫组化(IHC)染色，获得S100A7免疫组化染色典型图片。 (2)采用RT-qPCR方法和蛋白质印迹法(Western Blotting)检测银屑病皮损和正常皮肤组织中MSX2P1和S100A7的表达情况，并对MSX2P1和S100A7的表达水平进行相关性分析。 研究结果： (1)H&E染色结果显示，临床患者皮损处留取的10例标本均符合寻常型银屑病组织病理学改变。IHC染色结果显示，银屑病患者表皮角质形成细胞中S100A7呈弥漫性高表达，显著高于正常皮肤组织。 (2) RT-qPCR结果表明，在10例银屑病皮损中，MSX2P1和S100A7表达水平均高于正常皮肤组织，差异显著具有统计学意义(P＜0.001)。Western Blotting结果显示，在MSX2P1高表达的银屑病皮损中，S100A7蛋白的表达呈强阳性;在MSX2P1低表达的正常皮肤组织中，S100A7蛋白的表达呈弱阳性。S100A7的表达水平与MSX2P1呈正相关关系(R=0.635，P=0.0487)。 第三部分 LncRNA-MSX2P1通过竞争性结合miR-6731-5p对S100A7的调控作用及机制 研究方法： (1)通过转染lenti-shMSX2P1，干扰MSX2P1表达，RT-qPCR和WesternBlotting检测IL-22介导的角质形成细胞中MSX2P1、miR-6731-5p和S100A7表达水平变化;通过CCK-8、流式细胞术和膜联蛋白V/PI染色检测干扰MSX2P1表达后对IL-22介导的角质形成细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响;采用ELISA法检测细胞因子IL-23、TNF-α、IL-12β表达水平变化，Western Blotting检测IL-23、NF-κB(p65)、TNF-α、IL-12β、HLA-C和CCHCR1蛋白表达水平变化。 (2)转染miR-6731-5p mimics和miR-6731-5p inhibitor，RT-qPCR和Western Blotting检测IL-22介导的角质形成细胞中miR-6731-5p和S100A7表达水平变化;通过CCK-8、流式细胞术和膜联蛋白V/PI染色检测转染miR-6731-5pmimics和miR-6731-5p inhibitor后对IL-22介导的角质形成细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。 (3)采用双荧光素酶报告基因实验，分别检测MSX2P1与miR-6731-5p及miR-6731-5p与S100A7的结合情况，进行靶基因验证。 研究结果： (1)通过转染lenti-shMSX2P1，干扰MSX2P1表达，发现MSX2P1的表达水平显著下调(P＜0.01)，说明干扰成功;同时，S100A7mRNA和S100A7蛋白表达水平也明显降低;而miR-6731-5p mRNA表达明显上调(P＜0.01); CCK-8结果表明，干扰MSX2P1表达后，IL-22介导的角质形成细胞增殖活性显著降低(P＜0.01);流式细胞术检测发现，干扰MSX2P1的表达诱导了IL-22介导的角质形成细胞周期由G1期向S期转变停滞，起到抑制细胞生长的作用;膜联蛋白V/PI染色发现，干扰MSX2P1表达后，IL-22介导的角质形成细胞凋亡活性显著升高(P＜0.001)。 (2)转染miR-6731-5p inhibitor组RT-qPCR结果显示，miR-6731-5pmRNA表达水平明显下调(P＜0.01)，说明miR-6731-5p inhibitor转染成功;同样的，miR-6731-5p inhibitor显著上调S100A7 mRNA和S100A7蛋白表达水平(P＜0.01); CCK-8结果表明，转染miR-6731-5p inhibitor组细胞增殖能力相比对照组显著升高(P＜0.01);流式细胞术检测发现，转染miR-6731-5p mimics组通过使细胞周期由G1期向S期转变停滞，起到抑制细胞生长的作用;膜联蛋白V/PI染色发现，相比于阴性对照组，转染了miR-6731-5p mimics组细胞凋亡活性显著增加，而转染miR-6731-5p inhibitor组细胞凋亡活性显著降低(P＜0.001)。 研究结论： (1) MSX2P1和S100A7在银屑病皮损中高表达。 (2)在HaCaT和HNEK中，IL-22能够上调MSX2P1和S100A7的表达。 (3) S100A7是miR-6731-5p的直接靶基因。 (4) miR-6731-5p负向调控S100A7，抑制IL-22介导的角质形成细胞增殖并促进细胞凋亡作用。 (5) MSX2P1作为一种内源性“miRNA海绵”直接结合miR-6731-5p，对miR-6731-5p表达起负调控作用。 (6)MSX2P1通过抑制miR-6731-5p，间接激活S100A7的表达和其他炎症因子的分泌，发挥促进角质形成细胞增殖、抑制凋亡作用，促进银屑病进程。 综上所述，本研究结果揭示了MSX2P1作为竞争性内源性RNA分子，通过结合miR-6731-5p间接调控S100A7在角质形成细胞中的作用和分子机制，为更深入的了解银屑病中lncRNA介导的基因调控机制提供新视角，为银屑病的靶向治疗提供新思路。