右美托咪定对大鼠幼睾丸间质细胞雄激素合成的影响

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:troy003
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研究目的:
  包括医源性因素(如麻醉药物)在内的诸多因素可导致生殖健康问题,探索相关机制对于维护生殖健康具有重要意义。睾丸间质细胞(Leydigcell,LC)是男性生殖的重要内分泌细胞,主要功能是生成睾酮,但其调控发育的机制尚不明了。雄性青春期性发育主要依赖青春期的睾丸间质细胞分化。大鼠睾丸间质细胞在出生后第21天分化为祖睾丸间质细胞,第35天分化为幼睾丸间质细胞,第56天分化为功能成熟的成年睾丸间质细胞并产生足够的睾酮,而大鼠青春期性发育从第35天开始进行,即幼睾丸间质细胞发育阶段。右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)是一种咪唑化合物,有独到的镇静作用,可引起镇静而不会导致呼吸抑制,是围手术期常用的镇静麻醉药。DEX在心血管系统具有一定副作用,但在生殖领域的毒副作用研究尚不充分。在目前的研究中,我们通过体外实验研究了DEX对大鼠幼睾丸间质细胞(ImmatureLeydigcell,ILC)雄激素生成的影响,试图深入阐明DEX对睾丸间质细胞的影响机制,为进一步揭示各种生殖功能障碍奠定基础。
  研究方法:
  随机选取18只35日龄的雄性SpragueDawley(SD)大鼠,二氧化碳窒息法处死后,采用Percoll梯度离心法分离纯化ILC。在6孔板中铺上分离纯化后的ILC,每个孔含1.0×106个细胞分离出来的的睾丸间质细胞,在分离提纯培养24h后,用于体外实验。分别用不同浓度的DEX(0、0.015、0.15和1.5μM)处理3小时,收集培养基上清并采用免疫放射法测定培养基中的5α-雄甾烷二醇(5α-androstanediol,DIOL)和睾酮水平(Testosterone,T),收集部分睾丸间质细胞通过Trizol法提取RNA进行实时荧光定量核酸扩增检测(QPCR),测定LC的雄激素合成和代谢相关基因,包括Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Srd5a1和Akr1c14的表达水平;收集部分睾丸间质细胞提取蛋白进行蛋白印迹检测(Westernblot,WB),测量CYP17A1和SRD5A1等LC蛋白表达水平以及各组细胞的磷酸化ERK、AKT1蛋白以及其总蛋白水平。同时在培养基中分别加入促黄体激素(Luteinizinghormone,LH)和8溴-环磷酸腺苷酸(8-Bromoadenosine-3,5-cyclicadenosinemonophosphate,8BR)以及类固醇底物—22R-羟基胆固醇(22R-hydroxycholesterol,22R)、孕烯醇酮(Pregnenolone,P5)、孕酮(Progesterone,P4)、雄烯二酮(Androstenedione,D4)、T和二氢睾酮(Dihydrotestosterone,DHT)进行酶学底物实验,检测DEX作用具体靶点。用0、0.15和1.5μM的DEX处理提纯的幼睾丸间质细胞24小时,通过流式细胞术检测细胞内活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)生成以及细胞凋亡率。
  研究结果:
  采用Percoll梯度离心法分离纯化幼睾丸间质细胞,分别用0、0.015、0.15和1.5μM的DEX处理幼睾丸间质细胞3h后,DEX浓度依赖性地抑制培养基中雄激素水平,QPCR结果表明DEX同时下调了Cyp17a1和Srd5a的mRNA表达水平。DEX同样阻断了LH和cAMP刺激的雄激素分泌,提示DEX通过作用于LH-cAMP级联抑制雄激素分泌。暴露于1.5μMDEX还能直接抑制大鼠睾丸胆固醇侧链的裂解,3-β羟基类固醇脱氢和17α-羟基化。在底物实验中,在1.5μM浓度下,DEX抑制22R、P5、P4和DHT介导的DIOL的合成,说明DEX通过作用于这些靶点降低睾丸间质细胞雄激素的合成。蛋白印迹的结果表明DEX下调了CYP17A1和SRD5A1的蛋白表达,同时参与睾丸间质细胞功能调节的AKT1和ERK1/2信号通路也受到了抑制。进一步的研究表明,通过流式细胞术检测发现暴露于0、0.15和1.5μM浓度的DEX,睾丸间质细胞内的活性氧水平呈现不同程度地升高,并且细胞凋亡率呈剂量依赖性地升高,可能由此导致雄激素生成减少。
  结论:体外实验表明DEX直接抑制某些雄激素合成酶的活性,下调雄激素合成基因Cyp17a1和Srd5a1及其蛋白水平的表达,增加细胞内ROS的产生并诱导细胞凋亡,从而导致幼睾丸间质细胞中雄激素的产生减少。
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