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研究目的：
包括医源性因素（如麻醉药物）在内的诸多因素可导致生殖健康问题，探索相关机制对于维护生殖健康具有重要意义。睾丸间质细胞（Leydigcell，LC）是男性生殖的重要内分泌细胞，主要功能是生成睾酮，但其调控发育的机制尚不明了。雄性青春期性发育主要依赖青春期的睾丸间质细胞分化。大鼠睾丸间质细胞在出生后第21天分化为祖睾丸间质细胞，第35天分化为幼睾丸间质细胞，第56天分化为功能成熟的成年睾丸间质细胞并产生足够的睾酮，而大鼠青春期性发育从第35天开始进行，即幼睾丸间质细胞发育阶段。右美托咪定（Dexmedetomidine，DEX）是一种咪唑化合物，有独到的镇静作用，可引起镇静而不会导致呼吸抑制,是围手术期常用的镇静麻醉药。DEX在心血管系统具有一定副作用，但在生殖领域的毒副作用研究尚不充分。在目前的研究中，我们通过体外实验研究了DEX对大鼠幼睾丸间质细胞（ImmatureLeydigcell，ILC）雄激素生成的影响，试图深入阐明DEX对睾丸间质细胞的影响机制，为进一步揭示各种生殖功能障碍奠定基础。
研究方法：
随机选取18只35日龄的雄性SpragueDawley（SD）大鼠，二氧化碳窒息法处死后，采用Percoll梯度离心法分离纯化ILC。在6孔板中铺上分离纯化后的ILC，每个孔含1.0×106个细胞分离出来的的睾丸间质细胞，在分离提纯培养24h后，用于体外实验。分别用不同浓度的DEX（0、0.015、0.15和1.5μM）处理3小时，收集培养基上清并采用免疫放射法测定培养基中的5α-雄甾烷二醇（5α-androstanediol，DIOL）和睾酮水平（Testosterone，T），收集部分睾丸间质细胞通过Trizol法提取RNA进行实时荧光定量核酸扩增检测（QPCR），测定LC的雄激素合成和代谢相关基因，包括Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Srd5a1和Akr1c14的表达水平；收集部分睾丸间质细胞提取蛋白进行蛋白印迹检测（Westernblot，WB），测量CYP17A1和SRD5A1等LC蛋白表达水平以及各组细胞的磷酸化ERK、AKT1蛋白以及其总蛋白水平。同时在培养基中分别加入促黄体激素（Luteinizinghormone，LH）和8溴-环磷酸腺苷酸（8-Bromoadenosine-3,5-cyclicadenosinemonophosphate，8BR）以及类固醇底物—22R-羟基胆固醇（22R-hydroxycholesterol，22R）、孕烯醇酮（Pregnenolone，P5）、孕酮（Progesterone，P4）、雄烯二酮（Androstenedione，D4）、T和二氢睾酮（Dihydrotestosterone，DHT）进行酶学底物实验，检测DEX作用具体靶点。用0、0.15和1.5μM的DEX处理提纯的幼睾丸间质细胞24小时，通过流式细胞术检测细胞内活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）生成以及细胞凋亡率。
研究结果：
采用Percoll梯度离心法分离纯化幼睾丸间质细胞，分别用0、0.015、0.15和1.5μM的DEX处理幼睾丸间质细胞3h后，DEX浓度依赖性地抑制培养基中雄激素水平，QPCR结果表明DEX同时下调了Cyp17a1和Srd5a的mRNA表达水平。DEX同样阻断了LH和cAMP刺激的雄激素分泌，提示DEX通过作用于LH-cAMP级联抑制雄激素分泌。暴露于1.5μMDEX还能直接抑制大鼠睾丸胆固醇侧链的裂解，3-β羟基类固醇脱氢和17α-羟基化。在底物实验中，在1.5μM浓度下，DEX抑制22R、P5、P4和DHT介导的DIOL的合成，说明DEX通过作用于这些靶点降低睾丸间质细胞雄激素的合成。蛋白印迹的结果表明DEX下调了CYP17A1和SRD5A1的蛋白表达，同时参与睾丸间质细胞功能调节的AKT1和ERK1/2信号通路也受到了抑制。进一步的研究表明，通过流式细胞术检测发现暴露于0、0.15和1.5μM浓度的DEX，睾丸间质细胞内的活性氧水平呈现不同程度地升高，并且细胞凋亡率呈剂量依赖性地升高，可能由此导致雄激素生成减少。
结论：体外实验表明DEX直接抑制某些雄激素合成酶的活性，下调雄激素合成基因Cyp17a1和Srd5a1及其蛋白水平的表达，增加细胞内ROS的产生并诱导细胞凋亡，从而导致幼睾丸间质细胞中雄激素的产生减少。
包括医源性因素（如麻醉药物）在内的诸多因素可导致生殖健康问题，探索相关机制对于维护生殖健康具有重要意义。睾丸间质细胞（Leydigcell，LC）是男性生殖的重要内分泌细胞，主要功能是生成睾酮，但其调控发育的机制尚不明了。雄性青春期性发育主要依赖青春期的睾丸间质细胞分化。大鼠睾丸间质细胞在出生后第21天分化为祖睾丸间质细胞，第35天分化为幼睾丸间质细胞，第56天分化为功能成熟的成年睾丸间质细胞并产生足够的睾酮，而大鼠青春期性发育从第35天开始进行，即幼睾丸间质细胞发育阶段。右美托咪定（Dexmedetomidine，DEX）是一种咪唑化合物，有独到的镇静作用，可引起镇静而不会导致呼吸抑制,是围手术期常用的镇静麻醉药。DEX在心血管系统具有一定副作用，但在生殖领域的毒副作用研究尚不充分。在目前的研究中，我们通过体外实验研究了DEX对大鼠幼睾丸间质细胞（ImmatureLeydigcell，ILC）雄激素生成的影响，试图深入阐明DEX对睾丸间质细胞的影响机制，为进一步揭示各种生殖功能障碍奠定基础。
研究方法：
随机选取18只35日龄的雄性SpragueDawley（SD）大鼠，二氧化碳窒息法处死后，采用Percoll梯度离心法分离纯化ILC。在6孔板中铺上分离纯化后的ILC，每个孔含1.0×106个细胞分离出来的的睾丸间质细胞，在分离提纯培养24h后，用于体外实验。分别用不同浓度的DEX（0、0.015、0.15和1.5μM）处理3小时，收集培养基上清并采用免疫放射法测定培养基中的5α-雄甾烷二醇（5α-androstanediol，DIOL）和睾酮水平（Testosterone，T），收集部分睾丸间质细胞通过Trizol法提取RNA进行实时荧光定量核酸扩增检测（QPCR），测定LC的雄激素合成和代谢相关基因，包括Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Srd5a1和Akr1c14的表达水平；收集部分睾丸间质细胞提取蛋白进行蛋白印迹检测（Westernblot，WB），测量CYP17A1和SRD5A1等LC蛋白表达水平以及各组细胞的磷酸化ERK、AKT1蛋白以及其总蛋白水平。同时在培养基中分别加入促黄体激素（Luteinizinghormone，LH）和8溴-环磷酸腺苷酸（8-Bromoadenosine-3,5-cyclicadenosinemonophosphate，8BR）以及类固醇底物—22R-羟基胆固醇（22R-hydroxycholesterol，22R）、孕烯醇酮（Pregnenolone，P5）、孕酮（Progesterone，P4）、雄烯二酮（Androstenedione，D4）、T和二氢睾酮（Dihydrotestosterone，DHT）进行酶学底物实验，检测DEX作用具体靶点。用0、0.15和1.5μM的DEX处理提纯的幼睾丸间质细胞24小时，通过流式细胞术检测细胞内活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）生成以及细胞凋亡率。
研究结果：
采用Percoll梯度离心法分离纯化幼睾丸间质细胞，分别用0、0.015、0.15和1.5μM的DEX处理幼睾丸间质细胞3h后，DEX浓度依赖性地抑制培养基中雄激素水平，QPCR结果表明DEX同时下调了Cyp17a1和Srd5a的mRNA表达水平。DEX同样阻断了LH和cAMP刺激的雄激素分泌，提示DEX通过作用于LH-cAMP级联抑制雄激素分泌。暴露于1.5μMDEX还能直接抑制大鼠睾丸胆固醇侧链的裂解，3-β羟基类固醇脱氢和17α-羟基化。在底物实验中，在1.5μM浓度下，DEX抑制22R、P5、P4和DHT介导的DIOL的合成，说明DEX通过作用于这些靶点降低睾丸间质细胞雄激素的合成。蛋白印迹的结果表明DEX下调了CYP17A1和SRD5A1的蛋白表达，同时参与睾丸间质细胞功能调节的AKT1和ERK1/2信号通路也受到了抑制。进一步的研究表明，通过流式细胞术检测发现暴露于0、0.15和1.5μM浓度的DEX，睾丸间质细胞内的活性氧水平呈现不同程度地升高，并且细胞凋亡率呈剂量依赖性地升高，可能由此导致雄激素生成减少。
结论：体外实验表明DEX直接抑制某些雄激素合成酶的活性，下调雄激素合成基因Cyp17a1和Srd5a1及其蛋白水平的表达，增加细胞内ROS的产生并诱导细胞凋亡，从而导致幼睾丸间质细胞中雄激素的产生减少。