目的伴随社会老龄化问题日益加剧,阿尔茨海默病(AD)已成为全世界共同关注的议题,其患病率、发病率的上升与年龄的增长成指数关系,而其高患病率不仅影响患者的生理、心理和经济,并且也影响医护人员、患者的家属与朋友、医疗卫生体系和整个社会。因此,加强研究AD的病因、发病机制,探索有效的防治方法与药物,有着非常重要的临床价值和现实意义。本课题旨在论述AD基本病因病机的基础上,探讨AD的治则治法,并在成功分离、培养海马神经元,构建pEGFP-C1-CAV1质粒、CAV1-shRNA慢病毒,建立目前公认的AD体外模型基础上,观察固本健脑法治疗AD的作用及机制,为中医药治疗AD的深入研究提供理论基础和实验依据。方法(1)通过分离新生鼠大脑,解剖其海马,分离、培养海马神经元生长,进行形态学观察,并用MAP-2、Tau作为神经元的标记,对培养的海马神经元进行免疫荧光及免疫印迹鉴定。(2)设计带酶切位点及保护碱基的引物,摸索CAV-1 PCR反应的退火温度；将pEGFP-C1载体及CAV-1基因用EcoR Ⅰ, Sal Ⅰ双酶切,其酶切产物进行电泳鉴定并回收；将其鉴定阳性的CAV-1基因与线性载体进行T4连接酶连接,及DH5a感受态过夜转化,小量提取重组质粒,并双酶切及电泳鉴定,将电泳鉴定阳性的质粒进行测序验证；扩大培养测序正确的含质粒的细菌并保留菌种,再大量提取(去内毒素)重组质粒,并检测其浓度,最后进行海马神经元转染预实验。(3)设计CAV-1的shRNA靶点序列和针对CAV-1的2对干扰寡核苷酸序列,在RNA干扰正义链和反义链中均以Loop结构相连形成发卡状结构,构建含有GFP报告基因的CAV1基因shRNA慢病毒载体,并通过测序进行鉴定；用构建好的shRNA-CAVl慢病毒感染293T细胞,感染72h后根据各组表达GFP荧光的数目及稀释倍数,计算病毒滴度,并进行海马神经元感染预实验。(4)制备含药血清,用MTT法测不同浓度含药血清对细胞的影响；A β1-42溶于无菌三蒸水稀释,使其终浓度为2.5mmol/L,37℃孵育3d,制成聚集状态的Aβ1-42,诱导大鼠海马神经元,根据不同诱导时间点神经元的存活率、细胞形态及p-Tau蛋白表达水平,选择最佳诱导时长。(5)用构建成功的CAV1-shRNA慢病毒感染正常海马神经元,以沉默CAV-1基因；用构建成功的pEGFP-C1-CAV1质粒转染正常海马神经元,以过表达CAV-1基因；用含药血清进行干预。经Western blot定量分析CAV-1、GSK-3β、p-Tau水平,用以判断/证实CAV-1蛋白在调节GSK-3β、p-Tau水平是关键因素。(6)用构建成功的pEGFP-C1-CAV1质粒转染海马神经元,以过表达CAV-1基因；用A β1-42诱导海马神经元,建立AD细胞模型；用含药血清进行干预。经显微镜下观察细胞形态及荧光、Western blot定量分析CAV-1、GSK-3β、p-Tau水平,用以探讨固本健脑法对Tau蛋白过度磷酸化的影响。结果1.新生大鼠海马神经元的原代培养神经元形态学观察：培养4小时后,刚贴壁的细胞圆而透明,折光性好,胞体较大的细胞约占胞体较小细胞的1/3,分布均匀。第1天,能见少数胞体较大的细胞有突起生成。第2天,约1/3细胞见突起增多。第3天,见细胞胞体增大较快且长突起的细胞数目也有所增加。第4天,神经元突起进一步增多并延长,初步形成稀疏的网状。第5天,神经元胞体逐渐增大,胞突主干和分枝明显延长并增粗,形成更加稠密的网络。第7天,细胞稍有聚集,细胞突起长度明显增长,形成较为完整的网络。2.海马神经元的鉴定免疫荧光鉴定结果：荧光显微镜下的绿色荧光即为海马神经元树突,红色荧光即为海马神经元轴突,二者的叠加图即为海马神经元的突起(树突与轴突)。免疫印迹鉴定结果：第1天时由于细胞较少,只有少量神经元有突起,故MAP-2、Tau蛋白的表达量均很少；第3天神经元树突、轴突的数量有所增加,则MAP-2、au蛋白的表达量有所上升；第5天树突、轴突延长并增粗,形成网络,因此MAP-2、Tau的表达量已经较多。3.pEGFP-C1-CAV1质粒构建与表达重组质粒单向测序结果与NCBI的Gene Bank上大鼠CAV-1基因序列BLAST同源性达100%,且酶切位点前后与质粒载体序列一致,无碱基突变、缺失,证实了构建质粒的正确性。用质粒与脂质体比为5 μ1：7.5 μ1进行转染,能获得较好的GFP荧光表达(转染效率),及良好的细胞状态。4. shRNA-CAV1慢病毒构建与表达重组慢病毒测序结果表明CAV-1 shRNA的结构序列正确,其碱基峰图无缺失,无叠峰。病毒滴度(取平均值)为9×108TU/ml,表示每毫升中含有能够感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数为9x108个,有足够的感染力。预实验取得最优病毒感染复数MOI值为10,在靶细胞海马神经元中表达良好。5.含药血清的制备及AD细胞模型评价不同浓度的含药血清对海马神经元的抑制率,与浓度成递增关系,中、西药含药血清浓度在10%时与空白血清对比无差异,为保持实验一致性,故选择10%的含药血清干预。A β1-42诱导海马神经元随时间延长,其细胞活力逐渐下降,在12h存活率为79%,在24-36h存活率在60%以下；12h后细胞边界模糊,开始出现聚集、回缩,部分细胞突起减少,在24-48h出现突起断裂、细胞坏死；p-Tau-Ser396蛋白表达水平也随时间递增,在12h达到最高,但在24h反而下降,这是由于24h细胞坏死导致蛋白表达减少。为保证神经元较好活力、获得较好形态及导致Tau蛋白异常磷酸化,我们选择诱导时长为12h。6.固本健脑法对海马神经元CAV-1、p-Tau水平的影响在正常海马神经元中沉默CAV-1基因,即下调CAV-1水平,会引起GSK-3β在Ser9位点的磷酸化降低,在Tyr216位点的磷酸化升高,激活了GSK-3β的活性,使Tau蛋白在Thr231和Ser396位点的磷酸化升高；过表达CAV-1基因,即上调CAV-1水平,会引起GSK-3β在Ser9位点的磷酸化升高,在Tyr216位点的磷酸化降低,抑制了GSK-3β的活性,使Tau蛋白在Thr231和Ser396位点的磷酸化降低。7.固本健脑法对AD海马神经元CAV-1、p-Tau水平的影响造模12h后,倒置显微镜下观察模(+)组神经元出现大量突起断裂,胞体解体严重,状态很差,表明造模效果理想；而固(+)组虽然也有少量死细胞出现,神经元部分突起断裂,但总体生长状态尚且良好。可见固本健脑液含药血清的处理对A β1-42诱导的海马神经元有一定保护作用,可以很大程度上改善其生长状态,延缓其衰退和凋亡。在AD海马神经元中,A β1-42造模后引起GSK-3β在Ser9位点的磷酸化降低,在Tyr2’6位点的磷酸化升高,激活了GSK-3β的活性,使Tau蛋白在Thr231和Ser396位点的异常磷酸化。而用固本健脑液含药血清干预及过表达CAV-1后,升高了p-GSK-3β Ser9,降低了p-GSK-3β Tyr216,抑制了GSK-3β的活性,使Tau蛋白在Thr231及Ser9位点的异常磷酸化降低。结论1.先后天之本亏虚,因虚致实,痰瘀蒙蔽清窍是老年性痴呆的基本病机,固本健脑法是其基本且有效的治法。2.固本健脑法能促进海马神经元及AD细胞中CAV-1蛋白水平的提高。3.调节CAV-1水平会引起海马神经元中GSK-3β活性的变化,进而引起p-Tau水平的变化,在此过程CAV-1蛋白是关键因素。4.固本健脑法可以通过增加CAV-1表达,使p-GSK-3 βSer9表达水平增加和p-GSK-3 β Tyr216表达水平降低,而使GSK-3β的活性被抑制,进而减少Tau蛋白的异常过度磷酸化。5.固本健脑法对海马神经元有较好的保护作用。