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为了永久、有效地保存我国优良地方绵羊品种乌珠穆沁羊的遗传资源,本研究利用低熔点琼脂糖包埋法制备了高分子量基因组DNA,将高分子量DNA经HindⅢ部分酶切后进行两次脉冲电泳分离所需大片段DNA,电洗脱回收,与Copy Control pCC1BAC载体连接,转化Transfor Max EPI300 Electrocompetent E. coli感受态细胞,挑取和保存克隆获得了乌珠穆沁羊细菌人工染色体(BAC)文库。该文库包含了153,600个BAC克隆,共保存在400块384孔板里,平均插入片段大小为90-100 kb,其中平均空载率为3.2%,假阳性克隆比例为0.86%。绵羊的基因组按3×10~9计算,根据文库的平均插入片段和克隆数,计算出文库的基因组覆盖率约为5倍〔100×10~3 bp(153,600×0.86)/ 3×10~9 bp〕,预计从文库中筛选到单拷贝基因的机率为99.4%。经连续转接培养100代后的BAC克隆DNA指纹图谱显示,文库克隆稳定性好,无重排缺失现象。为了有效利用所构建的乌珠穆沁羊细菌人工染色体文库,本研究采用Qpix多功能全自动机械手臂通过菌液的合并和混合克隆DNA的提取法建立了PCR筛选系统,PCR筛选系统分为菌液工作文库和DNA工作文库,分别包括40个超级池、400个板池、16个行池及10个列池的菌液和DNA。利用BM6465等26对覆盖绵羊染色体的微卫星标记物引物,对构建的乌珠穆沁羊细菌人工染色体(BAC)文库进行PCR筛选,筛选结果表明在文库中这些标记物均得到了阳性克隆,阳性克隆数在3-9个不等,平均克隆数为5.1,这与文库的5倍基因组覆盖率基本吻合。为了永久、有效地保存我国优良地方绵羊品种乌珠穆沁羊的遗传资源,并为外源基因在成纤维细胞中的表达与调控提研究供优质的靶细胞,本研究以乌珠穆沁羊耳缘组织为实验材料,采用贴壁培养法和冷冻生物学技术构建了样本含量为33的群体成纤维细胞库,共保存优质细胞147份,每份细胞数量为4×10~6,冻存代数在6代以内,细胞生物学各项检测都达到了美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细胞系鉴定标准。为了验证所构建的乌珠穆沁羊细菌人工染色体文库的质量,本研究利用干扰素诱导蛋白10基因对文库进行超级池、行池、列池及板池的PCR筛选,结果得到了6个阳性超级池,共获得8个阳性克隆,编号分别为USB0501F18/041、USB0501L18/041、USB1209A8/119、USB1405P10/135、USB2201C3/211、USB2206C3/216、USB2503D17/243及USB2902G8/282,阳性克隆的平均插入片段均在90kb左右,菌体PCR检测后得到大小片段约为322bp的条带。重组体pGEM-T-IP-10的测序报告显示,所得到的序列为绵羊IP-10基因序列。真核表达重组质粒pEGFP-N3-IP-10用Xhol I和BamH I双酶切后可见309bp大小的目的片段与4.7kb大小的载体带。重组表达载体pEGFP-N3-IP-10和没有插入外源基因的对照组pEGFP-N3质粒均能在乌珠穆沁羊体外培养的细胞中得到良好的表达,转染后48h表达效率最高(P<0.05),绿色荧光在细胞中均匀分布,细胞核的荧光较亮,可以看到转染的靶细胞正在增殖分裂。