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病毒性肝炎是严重危害人类身体健康的慢性传染病之一,全世界约有4亿人为乙肝病毒慢性感染者,主要分布在亚、非国家。我国是病毒性肝炎高发地区,以HBV感染为主。流行病学资料表明,我国有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者1.2亿人,约有3000万慢性乙型肝炎患者需要治疗。尽管乙肝疫苗已广泛使用,在一定程度上对乙肝有预防作用,但也存在不应答和不良反应。此外,慢性乙肝病人经5～20年后约有12％可发展为肝硬化,在肝硬化病人中大约20％患者最后发展为肝功能衰竭,约5％发展为肝癌。全世界每年死于HBV相关疾病者为2713万人,因此,WHO已把乙型肝炎列为第九大死因。
目前临床虽有众多药物用于慢性病毒性肝炎的治疗,包括抗病毒药、保肝(抗纤维化)药、免疫调控剂和中草药等,但仍存在诸多问题。抗乙肝病毒药物主要以核苷类似物及干扰素为主,其中核苷类药物虽具有一定的抗病毒作用,但其对共价闭环HBV DNA的清除作用尚不确定,停药后易反弹,且用药后可发生不同程度的病毒变异,影响临床长期应用。而干扰素的有效率在30-50％之间,且有一定的副作用。中药、免疫调控剂及保肝药对缓解临床症状,改善肝功能和抑制病毒复制也有一定疗效,但也存在个体差异大、疗效弱及反跳率高等不足。因此,研究高效,安全、反跳率低和不良反应小的新药尤其是具有病毒清除作用的药物仍是病毒性肝炎治疗的重要途径和关键所在。
慢性肝炎的临床治疗仍以药物为主,用药特点为种类多,用药周期长(数月或常年)和反复应用。目前我国每年用于慢性肝炎治疗的费用约100亿,并以约15％速度逐年递增。上述治疗药物中化学药物约占70％(其中抗病毒药约占40％),中药约占30％。由此可见,慢性病毒性肝炎的治疗不仅给国家和患者家庭造成巨大的经济和精神负担,同时也引起就业、升学等严重社会问题。
目前我国临床应用的抗病毒药多为国外药厂产品,具有我国自主知识产权的抗肝炎药寥寥无几。面对慢性肝炎如此巨大的用药人群和随之带来的用药负担,研究具有我国自主知识产权、高效、低毒、价格合适的抗肝炎新药不仅具有重大的社会意义,同时可产生可观的经济效益。中药复方KA-01由多种中药提取而成。本研究首先确定KA-01体内外抗HBV的作用,之后探讨其作用机理。以HBV生命周期中起关键作用的蛋白为靶点,利用BIAcore技术有目的地在中药复方中分析其有效部位和有效成分。
一.中药复方KA-01抗HBV的作用
为确定KA-01体外抗HBV的作用,采用HepG 2.2.15细胞模型,测定中药复方KA-01对细胞的最大无毒剂量是100μg/ml。ELISA法检测KA-01体外抗HBV活性,最大无毒剂量时KA-01对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分别为62.01％和30.59％,有明显作用。鸭乙肝模型体内实验中,KA-01也可降低鸭乙肝动物血清中DHBV DNA水平。提示KA-01在体内外有抗HBV作用。
二.中药复方KA-01作用机理的探讨
利用BIAcore技术、荧光定量PCR、激光共聚焦显微镜等方法对其机理进行探讨,BIAcore技术初步研究结果表明:KA-01与乙肝病毒结合靶点为HBsAg,而不是HBeAg。体外实验结果显示KA-01不仅对HBsAg有抑制作用,而且对HBeAg也有一定抑制作用,分析KA-01对HBeAg的抑制作用是通过其它途径。荧光定量PCR结果表明KA-01对HBV DNA有抑制作用,KA-01 100μg/ml组抑制率为24.86％。激光共聚焦显微镜实验结果也进一步显示KA-01可降低HBsAg,而在低于20μg/ml后与细胞对照组没有明显差异。
三.中药复方KA-01有效部位的研究
应用BIAcore技术分析KA-01及其主要组分A、B、C、D在相同条件下,与HBsAg及HBeAg蛋白靶点结合。并进一步应用HepG2.2.15细胞模型,ELISA法测定体外抗HBV活性。BIAcore研究结果显示:KA-01及其四种主要组分与HBsAg蛋白结合的响应值分别为228.2、183.7、162.1、39.1、66.6 RU,与HBeAg蛋白几乎没有结合。在最大无毒剂量时KA-01、A、B、C对2.2.15细胞分泌HBsAg抑制率分别为62.01％、54.26％、50.97％和17.54％,KA.01及其四种主要组分与HBsAg蛋白结合的响应值由大到小依次为KA-01、A、B、C。它们对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制效果也依次为KA-01及A、B和C。A为KA-01中的有效部位。
对KA-01中的有效部位A进行体内外抗HBV活性研究。最大无毒剂量时A对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分别为54.26％和14.15％。提示A在体外有抗HBV作用。体内抗HBV活性以鸭乙型肝炎病毒感染雏鸭模型,斑点杂交法观察其体内对鸭血清DHBV DNA水平的影响,Southern杂交法测定其对鸭肝组织中DHBV DNA水平的影响。DHBV感染雏鸭7天血清检测为阳性后,DHBV DNA感染鸭分为五组：盐水组,拉米夫定组,A药高剂量组(0.8g/kg/天),A药中剂量组(0.4g/kg/天),A药低剂量组(0.2g/kg/天)。灌胃给药,1天2次连续给药10天。给药前(T0),给药第5,10天(T5,T10)与停药后3天(P3)取血,DHBV DNA斑点杂交。拉米夫定组给药第5,10天(T5,T10)与给药前(T0)的OD值比较,鸭血清DHBV DNA水平明显下降,有非常显著性和显著性意义(P<0.01,0.05)。对鸭血清DHBV DNA抑制率与病毒对照组比较,给药第5天,有非常显著性差异(P<0.01)。A药0.8g/kg/天组给药后第5天(T5)和10天(T10)和停药后3天(P3)对鸭血清DHBV DNA有显著性意义(P<0.05)。0.4g/kg/天组,给药后第5天(T5)和10天(T10)和停药后3天(P3)对鸭血清DHBV DNA有一定作用。0.2g/kg/天组,给药后第5天(T5)和10天(T10)和停药后3天(P3)对鸭血清DHBV DNA无统计学意义。停药后拉米夫定组有反弹,而A药0.8g/kg/天组反弹不明显。Southern杂交法检测药物治疗鸭肝组织中的DHBV DNA,结果显示,肝组织中总DHBV DNA量没有明显减少。拉米夫定组感染鸭肝组织中总DHBV DNA量虽有所减少,但OD值结果比较显示,拉米夫定组与盐水组比较鸭肝组织中总DHBV DNA量无显著性差异。A药组鸭肝组织中总DHBV DNA量无明显变化。A可降低鸭乙肝动物血清中DHBV DNA水平,但对鸭肝组织中总DHBV DNA量无明显影响。提示A在体内外有抗HBV作用。
四.中药复方KA-01有效成分的研究
进一步分析有效成分,以HBsAg蛋白为靶点,BIAcore技术对A的单体A1、A2、A3和A4进行分析,并进行体外抗乙型肝炎病毒的研究。A1、A2、A3和A4与HBsAg蛋白结合的响应值分别为61.8、44.9、163.0、75.5(RU)。提示A3在体外有抗HBV作用。
本论文对复方药物KA-01体外实验表明,KA-01在体外有抗HBV作用。BIAcore技术、荧光定量PCR、激光共聚焦显微镜初步研究结果:KA-01与乙肝病毒结合靶点为HBsAg,而不是HBeAg。进一步研究KA-01中的主要组分,HBsAg蛋白为靶点的BIAcore技术实验结果与体外细胞实验的结果一致。初步认为HBsAg蛋白可做为靶点进行药物分析。A药在体外有抗HBV作用,A药体内对鸭血清DHBV DNA水平有显著性的影响,对肝组织中DHBV DNA水平无明显影响。结果显示A为具有抗乙型肝炎病毒作用的活性部位。但A药的作用比复方药物KA-01弱,说明复方有协同作用。