微小残留白血病（minimal residual disease MRD）是指临床缓解的白血病患者体内仍能检测到微量白血病细胞,这些残留的白血病细胞即是白血病复发的根源.目前,白血病骨髓缓解判断标准为骨髓原始细胞小于5%,由于白血病患者初发时能检测到的白血病细胞常为10¹²以上,因此骨髓形态学缓解患者体内白血病细胞可能很低也有可能高达10¹⁰。而传统形态学检测、细胞遗传学技术、荧光原位杂交、流式细胞术由于敏感度及特异性的限制很难准确反映患者体内白血病细胞的负荷,近年来发展的实时荧光定量（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术以其快速、灵敏、简便、特异、定量等优点被广泛应用。另外,和传统的预后特征,如患者年龄、白细胞数、染色体变异等相比,MRD水平综合反应了药代动力学、药物遗传学及白血病细胞对化疗敏感性。本文研究目的即是应用RQ-PCR技术建立一种特异性强、覆盖面广的微小残留白血病监测体系,为临床治疗提供参考。应用PCR技术检测MRD的关键是寻找肿瘤特异的基因标志,这种标志能可靠地代表恶性克隆,且在白血病病程中保持相对稳定。染色体易位产生的融合基因（fusion gene）是MRD检测的理想分子标志,但融合基因在白血病中表达率低,仅能覆盖25%-40%的白血病患者。急性淋巴细胞白血病患者免疫球蛋白基因重链（IgH）及T细胞受体（TCR）基因在干细胞向淋巴系分化时会发生特异性重排,形成淋巴细胞特有的V-D-J片断,可作为基因标志用于急性淋巴细胞白血病及淋巴瘤的MRD检测,但该基因标志具有个体特异性,不同患者重排方式不同,给临床定量检测带来困难,且在病情发展中易发生克隆转化,容易造成假阴性。因此临床迫切需要找到特异性强覆盖面广的泛基因标志,使MRD的检测惠及更多的患者。我们选取了当前在实体瘤中研究较多的中期因子基因（midkine,MDK）及PHLPP（PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase）基因作为研究目标,结合患者疾病状态,分析MDK及PHLPP基因作为MRD检测靶基因的可行性。MDK基因是肝素结合生长因子家族成员,位于11p11,它通过促有丝分裂和细胞增殖、促血管生成、诱导细胞恶性转化、抗凋亡等功能影响肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡,在人体多种肿瘤中mRNA及蛋白表达均增高。大量研究发现MDK基因还通过抗老化、介导细胞间耐药信号传递等机制诱导肿瘤耐药。目前针对MDK的研究多限于实体瘤中,其是否可作为MRD监测靶基因尚未见报道。另一新的抑癌基因PHLPP是2005年Newton等对磷酸激酶结合的PH结构域人类基因组数据库搜索得到的一种蛋白磷酸激酶,定位在18q21.33,研究证明该基因在胃癌、肠癌、乳腺癌细胞系中低表达,另一份与之相反的报道称该基因在急性髓性白血病及骨髓增生异常综合症患者中高表达而正常人及化疗缓解后低表达。因此,我们有必要检测PHLPP基因在白血病中的表达情况及分析其作为MRD监测靶基因的可行性。鉴于MRD在白血病患者治疗中的重要性及多基因联合监测对提示复发更有意义,本实验还建立了比较常用的六种融合基因及一种泛基因的检测方法,这七种靶基因分别是:①BCR-ABL融合基因是由9号染色体长臂上C-ab1原癌基因易位至22号染色体长臂的断裂点集中区bcr形成,95%以上的慢粒白血病患者和25%-30%成人急性淋巴细胞白血病患者的血细胞中可出现t（9,22）（q34,q11）。②AML1-ETO融合基因是由于染色体t（8,21）（q22,q22）形成,发生率10%-12%,绝大多数为AML-M2型患者,此融合基因为预后较好的标志。③PML-RARA为15号染色体上的PML基因与17号染色体上的RARa基因（维甲酸受体基因）易位融合产生,是AML-M3特异的融合基因,占青年新发病例的10-15%。④CBFβ-MYH11为急性髓系白血病（AML）M4Eo常见的融合基因,其染色体异常为Inv（16）（p13,q22）/t（16,16）（p13,q22）,此型患者预后良好。⑤MLL-AF4为涉及11q23/MLL基因最常见的异常,染色体异常为t（4,11）（q21,q23）,在急性白血病中发生率5%-10%,预后差。⑥SIL-TAL是T急性淋巴细胞白血病（T-ALL）最常见的融合基因,其染色体异常为del（1）（p32,p32）。⑦WT1基因（wilms tumor gene）是目前跟白血病相关性最强、研究最多的一个泛基因,是从wilms瘤患者肿瘤细胞中分离得到的一种抑癌基因。WT1基因经常在AML的原始细胞中表达,参与白血病发生过程,其表达的蛋白可保持白血病细胞的生存能力,研究证明WT1基因可作为残留白血病检测的靶基因。RQ-PCR技术由于使用特异的TaqMan探针,显著提高了PCR产物定量的准确性且减少了对产物进行操作的污染,真正实现了定量,检测敏感度可以达到1×(10^-5-10^-6水平。我们选取2007年3月至2008年3月在我院就诊的患者作为研究对象,其中急性髓性白血病116例,急性淋巴细胞白血病47例,慢性粒细胞白血病26例,骨髓增生异常综合症8例,健康献血员20例,造血干细胞移植供者10例,共检测标本643份。应用RQ-PCR技术检测患者MRD包括以下步骤:常规方法提取白血病患者骨髓RNA,逆转录为cDNA备用。在融合基因断裂点附近区域及泛基因跨内含子区域应用Beacon Designer 7.0设计软件设立上下游引物和探针,先进行残留白血病靶基因以及管家基因GADPH的定性PCR,将阳性标本扩增产物提取质粒后测浓度,并测量出拷贝数倍比稀释为不同梯度,进行荧光定量PCR作出标准曲线。取患者cDNA样本进行实时荧光定量扩增,利用管家基因作为外参照,根据标准曲线测出不同时期靶基因表达水平。结果:①PHLPP基因在处于增殖期的细胞中表达较高,与白血病疾病状态无相关性,不能作为MRD检测的靶基因;②MDK基因在成人ALL及AML中高表达,,MDK表达量的高低与性别、年龄、复发、复杂核型、起病白细胞高低无关,与白血病类型、中枢神经系统白血病、标准方案化疗不缓解有关,在急性淋巴细胞白血病、合并中枢神经系统白血病、两个疗程不缓解患者MDK基因表达量高,为预后不好的标志;MDK基因与临床疾病状态具有相关性,可以作为MRD检测的靶基因③8种靶基因联合检测,97%初治急性髓性白血病、95%初治急性淋巴细胞白血病可找到残留白血病检测靶基因;④8种靶基因表达水平与临床疾病状态相关,初治及复发样本靶基因表达水平高,缓解后样本较初治及复发样本靶基因的表达水平呈明显下降趋势,治疗前后两组数据进行平均数多重比较方差分析,结果有统计学意义（P＜0.05）;⑤MRD水平多次持续升高对提示复发有意义,MRD水平持续处于低水平预后较好。结论:在国际上首次应用RQ-PCR方法对MDK基因表达水平进行了连续动态监测,首次证明MDK基因可作为残留白血病监测的靶基因。证实PHLPP基因在处于增殖期的细胞中表达较高,与白血病疾病状态无关,不可作为残留白血病检测的靶基因。应用RQ-PCR技术对六种融合基因和两种泛基因表达水平连续动态监测,我们建立了覆盖面较广、特异性较强的残留白血病检测体系,多种靶基因联合监测对判断病情预测复发更有意义。