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该研究中,我们采用转染5LO的策略,研究神经细胞5LO功能,观察内源性表达5LO是否影响PC12细胞增殖、分化,是否影响细胞对一些致AD损伤因素如淀粉样蛋白、无营养因子等的反应性:1.将HindⅢ限制性酶切位点插入质粒pBI-G的多克隆位点中,再将PCR获得的5LO cDNA全序列克隆入该载体的HindⅢ限制性酶切位点插入质粒pBI-G的多克隆位点中,再将PCR获得的5LO cDNA全序列克HindⅢ限制性酶切位点插入质粒pBI-G的多克隆位点中,再将PCR获得的5LO cDNA全序列克隆入载体的HindⅢ和Sa/I位点获得诱导表达载体pBI-5LO.采用酶切分析及测序验证,对获得的载体进行确证.2.采用报告基因β-半乳糖苷酶组化染色的方法,在PC12细胞模型上对5LO Tet-On诱导表达系统进行工作测试,加入诱导剂多西环素1μg/ml孵育48h后,对细胞进行染色,阳性细胞被染为亮兰色,表明该诱导表达系统在PC12细胞上能够工作.3.诱导表达载体pBI-5LO采用FuGENE 6试剂转染PC12细胞,潮霉素50μg/ml加压筛选分离克隆,以测定报告基因β-半乳糖苷酶活生的方法进行初筛,然后用RT-PCR测定5LO mRNA Western blot测定5LO蛋白、反相HPLC测定5LO活性的方法进行确证,获得5LO诱导表达PC12细胞.4.采用绿荧光蛋白和5LO的融合研究5LO在PC12细胞的亚细胞定位,融合蛋白与核染料Hoechst33258共定位,表明5LO在PC12细胞可分布于细胞核内.5.采用倒置相差显微镜观察细胞形态、MTT法测定细胞增殖、NGF(200U/ml)诱导细胞分化等方法,发现在正常培养条件下5LO诱导表达对PC12细胞的形态、增殖和分化没有明显影响.6.采用台盘兰染色、MTT法、流式细胞仪等测定细胞死亡.淀粉样蛋白肽Aβ25-35(5μM)孵育48h,与对照相比,5LO诱导表达细胞死亡率显著增加;无血清培养48h,5LO表达细胞死亡率显著高于对照组;NGF诱导PC12细胞分化7d后,撤除NGF后48h,5LO表达也显著增加细胞的死亡率.7.采用测定细胞上清LDH活性的方法测定细胞损伤.5LO抑制剂AA861(5μM)、MK886(5μM)均能显著抑制Aβ25-35(5μM)诱导的细胞损伤.8.采用生化法测定超氧化物酶(SOD)、过氧化氢酶(Cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),MDA法测定脂质过氧化,DCF荧光法测定过氧化物水平,Ac-DEVD-AMC底物荧光法测定Caspase-3活性,RT-PCR方法测定凋亡相关基因的表达.5LO显著增强Aβ25-35诱导的SOD活性、MDA的水平、过氧化物的水平以及Caspase-3活性,抑制Cat、GSH-Px的活性和bcl-2基因的表达.该研究结果表明5LO促进淀粉样蛋白、无营养因子诱导的神经细胞死亡,5LO的作用与氧化应激、激活Caspase和下调bcl-2基因相关;提示5LO在老化和神经退行性病变中发挥作用,5LO途径可能成为神经保护治疗的靶点.