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本项目研究的目的旨在通过广泛的采样分离和筛选，以获取新的磷脂酶C产量高、磷脂酶C抗血小板功能强的微生物菌种，并对其所产磷脂酶C的纯化及特性进行研究，从而为今后将磷脂酶C研制开发成抗血小板聚集一类新药打下坚实的实验基础。
研究内容及所采用的主要方法如下：菌种分离采用卵黄LB平板分离法。菌种筛选采用卵黄硼砂平板酶活定性检测、菌生物量、NPPC法酶活定量检测以及抗血小板聚集率等多指标多轮次筛选。菌种的分类鉴定采用菌种的形态学特征、生理生化特征及16S rRNA序列等依据进行。磷脂酶C的发酵以三角瓶摇瓶培养为主。培养条件主要考虑培养基、接种量、培养温度、培养时间及摇床转速等对磷脂酶C产酶活水平的影响，条件优化采用正交实验方法。纯化制备采用离子交换吸附、离子交换层析、疏水层析及凝胶层析四种柱层析分离和超滤膜分离方法。磷脂酶C分子量测定采用SDS-PAGE法，磷脂酶C酶活力测定采用NPPC法，磷脂酶C溶血活性测定采用血平板法。磷脂酶C对血小板胞浆游离钙离子浓度的影响测定采用双波长荧光分光光度法。磷脂酶C对血小板肌动蛋白聚合的影响测定采用SDS-PAGE和分光光度法。磷脂酶C对血小板cAMP含量的影响测定采用放射性免疫法。
通过筛选共获得了四株新的高产磷脂酶C优良菌株，分别将其分类鉴定为：Bacillus cereus Shenzhen754-1、Bacillus mycoides Shenzhen779、Bacillus mycoidesShenzhen970和Bacillus mycoides Shenzhen1107。其中，Bacillus cereus Shenzhen754-1摇瓶培养产磷脂酶C的最佳产酶条件为：培养基(1％蛋白胨，0.3％牛肉膏)，培养温度28℃，培养时间20h，接种量1％，转速200 r/min。在此培养条件下，Bacillus cereusShenzhen754-1磷脂酶C的产酶水平达到28.8 U/ml。从Bacillus cereus Shenzhen754-1发酵上清液中分离纯化磷脂酶C的实验室工艺路线为：发酵上清液→离子交换吸附→超滤浓缩→离子交换层析→疏水层析→凝胶层析，磷脂酶C的纯化收率为25％，比活力为15370 U/mg，纯化倍率为40.8，样品纯度经SDS-PAGE检测达到一个条带。纯化的磷脂酶C样品分子量为75100。热稳定性较差，70℃水浴处理5min即可使酶全部失活。催化活性的发挥必需依赖金属阳离子，Ca2+、Mg2+、Zn2+及Ba2+可使其发挥催化活性，而Fe3+、Sn2+、Cu2+和Al3+不能使其使其发挥催化活性。该纯化的磷脂酶C样品在血平板上不表现任何的溶血活性。在NPPC反应系统中表现出的酶反应最适温度为60℃，最适pH值在pH7.0-7.2左右。
从2.5U/ml到20U/ml不同剂量的磷脂酶C对健康成人的血小板静息状态下的胞浆[Ca2+]i具有明显的影响。随着剂量的增加，静息态胞浆[Ca2+]i逐渐下降。而该剂量范围内的磷脂酶C对健康成人的血小板经ADP诱导激活后的胞浆[Ca2+]i的增加具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖关系。初步实验结果表明10U/ml的磷脂酶C对高血压病人的血小板静息态胞浆[Ca2+]i及经ADP诱导激活后的胞浆[Ca2+]i的增加也具有明显的影响和抑制作用。从5U/ml到25U/ml不同剂量的磷脂酶C对家兔和健康成人的血小板经ADP诱导激活后的肌动蛋白聚合作用具有明显的抑制作用。随着磷脂酶C剂量的增加，激活态血小板中的肌动蛋白微丝的含量逐渐下降。从5U/ml到25U/ml不同剂量的磷脂酶C对家兔的血小板经ADP诱导激活后的胞浆cAMP含量具有明显的影响。随着磷脂酶C剂量的增加，激活态血小板的胞浆cAMP含量明显提高。
总之，通过本项目研究，获得了四株新的产磷脂酶C微生物菌株，其中的Bacilluscereus Shenzhen754-1产磷脂酶C水平超过了国内外文献报道的最高产酶水平。其所产磷脂酶C的特性与其它微生物磷脂酶C的特性不一样。该磷脂酶C可通过胞浆钙离子浓度、肌动蛋白聚合以及cAMP含量等多种途径或机制来抑制血小板的聚集功能。