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目的:XX医院按照公立三级综合型医院规模建设,2016年5月18日正式投入使用。以往有关新建大型公立医院病原菌分布及耐药情况研究较少。本研究拟通过一系列实验,探讨新建医院菌株的耐药、流行趋势、感染分布特点等,以期为院感细菌耐药监测及临床合理使用抗菌药物、抗感染治疗提供实验室依据。为防控多重耐药细菌,尤其是耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌在医院的流行奠定理论基础。方法:一、临床病原菌感染分布特征及耐药性分析1、2017年12月至2018年12月,XX医院微生物室采用BD Phoenix-100 System全自动微生物分析仪培养鉴定致病菌,菌株均来自临床各科室送检标本培养所得。采用分析仪配套药敏卡进行药敏试验,对临床菌株进行最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）的分析。药敏结果判读参照2017年美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）标准。2、利用WHONET 5.4软件分析主要致病菌的菌株类别,标本类型,耐药表型及临床分布情况。二、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的分子特征研究1、菌株鉴定和药敏分析:采用BD公司BD Phoenix-100 System全自动微生物分析仪进行细菌的鉴定,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS）复核。耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae,CRE）通过K-B法药敏试验复核亚胺培南、美罗培南药敏。2、脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）分析:利用 PFGE 技术对部分菌株进行分析,判断标准为:相似度＞85%为同一克隆株。研究大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的临床分离株的流行病学相关性。3、CRE耐药基因的筛选:采用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）方法筛选碳青霉烯酶基因:blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48。4、全基因组测序:选取携带blaKPc的肺炎克雷伯菌进行全基因组序列测定分析。5、质粒接合转移实验:将筛选出的产碳青霉烯酶的供体菌和受体菌混合培养进行接合转移试验,采用PCR法筛选出阳性接合转移子。用S1-PFGE实验分析接合转移子质粒的携带情况。三、金黄色葡萄球菌的分子特征研究1、菌株鉴定和药敏分析:采用BD公司BD Phoenix-100 System全自动微生物分析仪进行细菌的鉴定,经MALDI-TOF-MS质谱仪复核。2、脉冲场凝胶电泳分析:利用PFGE技术对部分菌株进行分析,判断标准为:相似度＞85%为同一克隆株。研究金黄色葡萄球菌的临床分离株的流行病学相关性。3、采用PCR法检测金黄色葡萄球菌毒力基因pvl、tst。结果:一、临床病原菌感染分布特征及耐药性1、标本量7023例,共分离出1477例阳性菌,分离率为21.03%。同一患者同一菌种只统计一次,其中革兰阴性菌325株,革兰阳性菌300株。检出率较高的依次是创口分泌物、痰液、尿液,病原菌检出量较大的科室依次是神经外科、产科、呼吸内科、泌尿外科、普外科、消化内科、骨科等。2、革兰阴性菌中检出量较多的是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌,其次是铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、产酸克雷伯菌等。革兰阳性菌中检出量较多的是金黄色葡萄球菌,其次是无乳链球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、表皮葡萄球菌等。3、主要病原菌耐药情况分析,革兰阴性菌中,大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对第一代头孢菌素类头孢唑林耐药率较高,对碳青霉烯类、大多数β-内酰胺类抗生素耐药率较低。革兰阳性菌中金黄色葡萄球菌对青霉素类、红霉素耐药率较高,对利奈唑胺、替考拉宁、阿米卡星耐药率较低,无对万古霉素耐药的菌株。4、多重耐药菌情况分析,耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）16株,主要是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（CRPA）占比25%,耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（CR-AB）占比84%,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）占比38.32%,耐万古霉素肠球菌（VRE）占比5%。二、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的分子特征研究1、69株大肠埃希菌的PFGE结果显示,有七个菌株数量均为2株的克隆型,47株肺炎克雷伯菌的PFGE结果显示,有4个菌株数量均为2株的克隆型,临床资料显示这些菌株均来自不同时间段的不同科室,呈少量散在分布。2、PCR方法检测出8株CRE菌株携带碳青霉烯酶基因,分别是4株携带blaNDM、1株携带blaIMP,1株携带blaKPC,2株同时携带blaNDM和blaIMP。3、携带blaKPC的一株肺炎克雷伯菌二代全基因组序列测定分析显示其耐药基因分类中以KPC-2为主,ST分型为ST11型。4、接合转移实验中,两株携带NDM基因的大肠埃希菌,一株携带KPC基因的肺炎克雷伯菌接合转移成功,PCR法检测疑似接合转移子耐药基因,结果证实这些接合转移子均为携带相应碳青霉烯酶基因的质粒接合子。选取部分质粒接合转移子进行PFGE实验,内切酶选用酶切质粒的S1。PFGE结果显示这三株结合转移子均有携带耐药基因的质粒。三、金黄色葡萄球菌的分子特征研究1、32株金黄色葡萄球菌的PFGE结果显示,有四组菌株为同一克隆型,其中一组三株菌均来自同一时间段普外科标本培养所得,其余呈散在分布。2、金葡菌的毒力基因pvl和tst的阳性率均为25%。其中有2株同时携带tst和pvl基因。结论:1、该院临床病原菌分布及耐药情况大部分与其他同类别医疗单位相似,同时具有新建医院环境下独有分布特点。2、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌部分菌株同源性分析结果显示无主要克隆型,仅存在小范围克隆传播可能。金黄色葡萄球菌部分菌株同源性分析结果显示存在同一科室、同一时间段克隆传播情况。3、该院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因呈多样性,耐药情况不容乐观。4、金葡菌毒力基因tst、pvl携带率处于相对较高水平,在临床抗感染治疗过程中应引起重视。5、新建大型综合型公立医院使用之初即应严格做好感控工作,建议多部门联合监管,加强抗菌药物的合理使用,有效遏制细菌耐药局面,防止医院感染的发生。