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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)是世界范围内柑橘生产上的毁灭性病害，其病原为韧皮部限制性难培养革兰氏阴性菌α-变形杆菌。Tol-Pal操纵子在维持细胞形态及细胞增殖过程中具有重要功能，其中的PalCLas基因在许多革兰氏阴性菌的致病过程中发挥重要作用。本实验室前期研究表明：PalCLas基因具有PAMP活性，能引起烟草的过敏性坏死反应，导致胼胝体沉积、淀粉积累。为进一步明确Tol-Pal操纵子中各构成元件对柑橘黄龙病菌菌体形态、增殖及致病性的影响，本课题以苜蓿中华根瘤菌Rm1021为替代菌株，分别构建苜蓿中华根瘤菌Rm1021Tol-Pal操纵子中PalRm1021、TolBRm1021、TolQRm1021基因的敲除菌株，以及柑橘黄龙病菌PalCLas、TolBCLas、TolQCLas基因的回补菌株，并对其功能进行了研究，取得的主要结果如下:
1.构建并获得了Tol-Pal操纵子中重要组成元件Pal、TolB、TolQ基因的敲除和回补菌株：根据基因同源重组原理，成功构建了根瘤菌Rm1021Tol-Pal操纵子的敲除菌株ΔPalRm1021、ΔTolBRm1021、ΔTolQRm1021，以及柑橘黄龙病菌基因组内对应同源基因的回补菌株ΔPalRm1021/PalCLas::pBBR1MCS-5、ΔTolBRm1021/TolBCLas::pBBR1MCS-5和ΔTolBRm1021/TolCCLas::pBBR1MCS-5。
2.敲除菌株和回补菌株的生物学特性研究：利用激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察发现ΔPalRm1021和野生型菌株菌体形态存在明显差异，ΔPalRm1021菌体明显较野生型变小。ΔPalRm1021、ΔTolBRm1021、ΔTolQRm1021菌株的生长速率较野生型均变慢，突变体相互之间生长速率无明显差异：在36h后进入对数生长期，在52h后进入生长静止期；ΔTolBRm1021/TolBCLas::pBBR1MCS-5回补菌株可较高程度恢复野生型菌株生长速率。在耐盐性方面，随着NaCl浓度的增加，敲除菌株、回补菌株和野生型菌株的生长速率都变慢，且菌落变小；回补菌株可以完全恢复野生型水平。运动试验表明敲除菌株泳动和丛动能力都较野生型Rm1021变弱：泳动试验显示：野生型Rm1021泳动直径为0.87±0.21cm，ΔTolBRm1021、ΔPalRm1021、ΔTolQRm1021泳动直径介于0.4±0.018~0.5±0.049cm之间，在P=0.05水平上与野生型均存在显著性差异；回补菌株TolBRm1021/TolBCLas::pBBR1MCS-5、ΔTolQRm1021/TolQCLas::pBBR1MCS-5、ΔPalRm1021/PalCLas::pBBR1MCS-5均可在一定程度上恢复野生型菌株Rm1021的泳动能力，在P=0.05水平上差异不显著。丛动试验显示ΔTolBRm1021、ΔPalRm1021和ΔTolQRm1021扩散直径均变小，除ΔTolBRm1021与野生型Rm1021存在显著性差异(P=0.1)外，其余突变体菌株与野生型菌株丛动能力无显著性差异；回补菌株ΔTolBRm1021/TolBCLas::pBBR1MCS-5和ΔTolQRm1021/TolQCLas::pBBR1MCS-5均可完全恢复至野生型水平。在抗生素敏感性方面，青霉素浓度为5.0μg/mL时，野生型更为敏感，生长被完全抑制，但是敲除菌株仍可正常生长。当氨苄青霉素浓度为5.0μg/mL时，野生型可以正常生长，ΔPalRm1021和ΔTolQRm1021敲除菌株的生长被完全抑制，但ΔTolBRm1021仍可生长，敏感性低于野生型。试验证明敲除菌株比野生型Rm1021对氨苄青霉素更为敏感。回补菌株在抗生素平板上的生长状态与野生型一致。
3.对PalCLas基因过表达菌株和野生型菌株在生长速率与菌体形态等方面进行比较：过表达菌株的生长速率低于野生型菌株，PalCLas过表达菌株在约34h后进入对数生长期，在48h进入生长静止期，与野生型相比晚6h。PalCLas过表达菌株菌体形态存在明显变化：与野生型Rm1021相比菌体长度变短、宽度变宽、纵横比减小、周长和面积也均减小。
4.柑橘黄龙病菌PalCLas基因定位观察：运用融合PCR技术构建PalCLas基因与EGFP绿色荧光蛋白基因融合表达载体，通过三亲本接合试验转入根瘤菌Rm1021菌株，在激光共聚焦显微镜下观察发现：绿色荧光蛋白分布于整个菌体内，无明显的特异区域分布。
5.黄龙病菌Tol-Pal操纵子各元件互作研究：将PalCLas,TolBCLas,TolQCLas分别构建至AD、BD载体上共转酵母菌株Y2HGold进行互作分析。结果表明：PalCLas和TolBCLas共转菌落在四缺培养基QDO(SD/-His-Leu-Trp-Ade)上可以生长，并且在添加X-α-Gal的平板上产生蓝色菌落，证明二者之间存在互作关系，其它基因相互之间未观察到明显的互作反应。
1.构建并获得了Tol-Pal操纵子中重要组成元件Pal、TolB、TolQ基因的敲除和回补菌株：根据基因同源重组原理，成功构建了根瘤菌Rm1021Tol-Pal操纵子的敲除菌株ΔPalRm1021、ΔTolBRm1021、ΔTolQRm1021，以及柑橘黄龙病菌基因组内对应同源基因的回补菌株ΔPalRm1021/PalCLas::pBBR1MCS-5、ΔTolBRm1021/TolBCLas::pBBR1MCS-5和ΔTolBRm1021/TolCCLas::pBBR1MCS-5。
2.敲除菌株和回补菌株的生物学特性研究：利用激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察发现ΔPalRm1021和野生型菌株菌体形态存在明显差异，ΔPalRm1021菌体明显较野生型变小。ΔPalRm1021、ΔTolBRm1021、ΔTolQRm1021菌株的生长速率较野生型均变慢，突变体相互之间生长速率无明显差异：在36h后进入对数生长期，在52h后进入生长静止期；ΔTolBRm1021/TolBCLas::pBBR1MCS-5回补菌株可较高程度恢复野生型菌株生长速率。在耐盐性方面，随着NaCl浓度的增加，敲除菌株、回补菌株和野生型菌株的生长速率都变慢，且菌落变小；回补菌株可以完全恢复野生型水平。运动试验表明敲除菌株泳动和丛动能力都较野生型Rm1021变弱：泳动试验显示：野生型Rm1021泳动直径为0.87±0.21cm，ΔTolBRm1021、ΔPalRm1021、ΔTolQRm1021泳动直径介于0.4±0.018~0.5±0.049cm之间，在P=0.05水平上与野生型均存在显著性差异；回补菌株TolBRm1021/TolBCLas::pBBR1MCS-5、ΔTolQRm1021/TolQCLas::pBBR1MCS-5、ΔPalRm1021/PalCLas::pBBR1MCS-5均可在一定程度上恢复野生型菌株Rm1021的泳动能力，在P=0.05水平上差异不显著。丛动试验显示ΔTolBRm1021、ΔPalRm1021和ΔTolQRm1021扩散直径均变小，除ΔTolBRm1021与野生型Rm1021存在显著性差异(P=0.1)外，其余突变体菌株与野生型菌株丛动能力无显著性差异；回补菌株ΔTolBRm1021/TolBCLas::pBBR1MCS-5和ΔTolQRm1021/TolQCLas::pBBR1MCS-5均可完全恢复至野生型水平。在抗生素敏感性方面，青霉素浓度为5.0μg/mL时，野生型更为敏感，生长被完全抑制，但是敲除菌株仍可正常生长。当氨苄青霉素浓度为5.0μg/mL时，野生型可以正常生长，ΔPalRm1021和ΔTolQRm1021敲除菌株的生长被完全抑制，但ΔTolBRm1021仍可生长，敏感性低于野生型。试验证明敲除菌株比野生型Rm1021对氨苄青霉素更为敏感。回补菌株在抗生素平板上的生长状态与野生型一致。
3.对PalCLas基因过表达菌株和野生型菌株在生长速率与菌体形态等方面进行比较：过表达菌株的生长速率低于野生型菌株，PalCLas过表达菌株在约34h后进入对数生长期，在48h进入生长静止期，与野生型相比晚6h。PalCLas过表达菌株菌体形态存在明显变化：与野生型Rm1021相比菌体长度变短、宽度变宽、纵横比减小、周长和面积也均减小。
4.柑橘黄龙病菌PalCLas基因定位观察：运用融合PCR技术构建PalCLas基因与EGFP绿色荧光蛋白基因融合表达载体，通过三亲本接合试验转入根瘤菌Rm1021菌株，在激光共聚焦显微镜下观察发现：绿色荧光蛋白分布于整个菌体内，无明显的特异区域分布。
5.黄龙病菌Tol-Pal操纵子各元件互作研究：将PalCLas,TolBCLas,TolQCLas分别构建至AD、BD载体上共转酵母菌株Y2HGold进行互作分析。结果表明：PalCLas和TolBCLas共转菌落在四缺培养基QDO(SD/-His-Leu-Trp-Ade)上可以生长，并且在添加X-α-Gal的平板上产生蓝色菌落，证明二者之间存在互作关系，其它基因相互之间未观察到明显的互作反应。